การแยกให้บริสุทธิ์ และตรวจสอบของโบรมิเลนจากต้นสับปะรด

Abstract

การวิจัยเพื่อเพิ่มความบริสุทธิ์ของผงโบรมิเลนที่เตรียมโดยการตกตะกอนด้วยอะซีโตนให้สูงจขึ้นด้วยเทคนิคการไดอะไลซีส อุลตราฟิลเตรชัน คูโอไลซ์ ซี225 และเซฟาเดกซ์ จี 100 โครมาโตกราฟฟี พบว่า เทคนิคดังกล่าวไม่สามารถเพิ่มความบริสุทธิ์ขิง เอนไซม์ให้สูงขึ้นได้ไม่มากนัก (~ 1.4-2 เท่า) แอคติวิตีของผงโบรมิเลนมีค่าประมาณ 281-604 หน่วยซีดียูต่อมิลลิกรัมผง แอคติววิตีของโบรมิเลนในน้ำสกัดจากต้น สับปะรดสามารถกระตุ้นให้สูงขึ้นได้ด้วยกรดอะมิโนซีสเทอีนไฮโดรคลอไรด์ และโซเดียมเมทาไบซัลไฟท์ กรด เอทธิลลีนไดอะมีนเททระอะซีทิคสามารถเสริมฤทธิ์การกระตุ้นแอคติวิตีของเอนไซม์โดยกรดอะมิโนซีสเทอีน ไฮโดรคลอไรด์ได้ประมาณ 1.5 เท่า ผงโบรมิเลนที่ทำให้บริสุทธิ์บางส่วนโดยการตกตะกอนด้วยกรดโพลีอะไคร์ลิคจะมีแอคติวิตีต่อมิลลิกรัมผงสูงกว่าผงโบรมิเลนจากการตกตะกอนโดยอะซีโตนประมาณ 4-5 เท่า (~ 1941 หน่วยซีดียูต่อมิลลิกรัมผง) และให้ผลผลิตประมาณ 1.2 กรัมต่อกิโลกรัมต้นสับปะรด การทำให้เอนไซม์จากผงโบรมิเลนที่เตรียมได้บริสุทธิ์สูงขึ้นโดยใช้เทคนิคอุลตราฟิลเตรชัน คาร์บอกซีเมทธิลเซลลูโลสโครมาโตกราฟฟี เซฟาเดกซ์ จี 100 โครมาโตกราฟฟี หรือเทคนิคร่วมของคาร์บอกซีเมทธิลเซลลูโลสกับเซฟาเดกซ์ จี 100 โครมาโตกราฟฟีไม่มีผลในการเพิ่มแอคติวิตีของเอนไซม์ แต่จากการตรวจสอบด้วยเทคนิคโพลีอะไดร์ละไมด์เจล อิเลคโตรโฟริซีสพบว่ามีชนิดของโปรตีนในผงโบรมิเลนลดลง ผงโบรมิเลนที่มีความบริสุทธิ์ สูงนี้จะมีคุณสมบัติต่าง ๆ ในการเร่งปฏิกิริยาการไฮโดรไลซ์เคซีนเกือบไม่แตกต่างกันกับผงโบรมิเลนก่อนเพิ่มความบริสุทธิ์ ยกเว้นเอนไซม์ที่มีความบริสุทธิ์สูงจะมีความเสถียรต่ออุณหภูมิลดลง เอนไซม์โบรมิเลนสามารถตรึงบนคาร์บอกซีเมทธิลเซลลูโลสและเสริมด้วยกลูตารัลดีไฮด์ได้ โดยที่เอนไซม์ตรึงทั้งชนิดเสริมและไม่เสริมด้วยกลูตารัลดีไฮด์จะเร่งปฏิกิริยา ได้สูงสุดที่อุณหภูมิต่ำกว่าเอนไซม์อิสระ (45 °ซ สำหรับเอนไซม์ตรึงและ 65 °ซ สำหรับเอนไซม์อิสระ) โบรมิเลนตรึงมีความเสถียรต่ออุณหภูมิ (30-50 °ซ) สูงกว่าเอนไซมิอิสระอย่างชัดเจน นอกจากนี้การตรึงเอนไซม์บนคาร์บอนซีเมทธิลเซลลูโลสจะทำให้ความสามารถในการไฮโดรไลซ์สับสเตรทเคซีนเพิ่มขึ้นประมาณ 15-20 เท่าเมื่อเทียบกับเอนไซม์อิสระ