การดัดแปลงลำดับนิวคลิโอไทด์บริเวณตำแหน่งที่ไรโบโซมจับของโอเพอรอน phaCAB เพื่อการผลิตพอลิ 3-ไฮดรอกซีบิวทิวเรด

ธเนศ ศรีโมรา

Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/78851

Title:	การดัดแปลงลำดับนิวคลิโอไทด์บริเวณตำแหน่งที่ไรโบโซมจับของโอเพอรอน phaCAB เพื่อการผลิตพอลิ 3-ไฮดรอกซีบิวทิวเรด
Other Titles:	Modification of ribosome binding site region of the phaCAB operon for poly(3-hydroxybutyrate) production
Authors:	ธเนศ ศรีโมรา
Advisors:	สุชาดา จันทร์ประทีป นภาธร
Other author:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
Subjects:	พลาสติกที่ย่อยสลายทางชีวภาพ โพลิเบตาไฮดรอกซีบิวทิเรต Biodegradable plastics Poly-beta-hydroxybutyrate
Issue Date:	2563
Publisher:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract:	การผลิตพลาสติกชีวภาพชนิดพอลิ 3–ไฮดรอกซีบิวทิเรต (PHB) ในรีคอมบิแนนท์ E. coli โดยการใช้ยีนชีวสังเคราะห์ที่เกี่ยวข้องกับการผลิต PHB โอเพอรอน phaCAB มีข้อดีกว่าสายพันธุ์ ดั้งเดิม เช่น สามารถเจริญเติบโตได้รวดเร็ว สามรถใช้อาหารราคาถูกได้ มีประสิทธิภาพในการผลิต PHB สูงรวมถึงไม่มีเงินไซม์ดีพอลิเมอไรเซชันด้วย โดยปกติแล้วโอเพอรอน phaCAB จะสามารถ แสดงออกได้ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์และตำแหน่งจับกับไรโบโซม (RBS) ซึ่งโปรโมเตอร์ที่ นิยมใช้กันนั้นมักเป็นโปรโมเตอร์เหนี่ยวนำที่ต้องใช้สารเคมี เช่น ไอโซพรอพิล บีต้า ดี หนึ่ง ไทโอ กาแล็คโตไพแรนโนไซด์ (IPTG) ซึ่งจะเป็นการเพิ่มมูลค่าของต้นทุนการผลิต งานวิจัยนี้มีจุดประสงค์ เพื่อศึกษาการใช้โปรโมเตอร์ที่สามารถทำงานได้แรงอย่างต่อเนื่องที่ชื่อว่า BBa_J23100 แทนการใช้ โปรโมเตอร์เหนี่ยวนำและได้สร้างไลบรารีของ RBS โดยใช้ไพรเมอร์ที่มีลำดับนิวคลิโอไทด์แบบสุ่มใน บริเวณตำแหน่งสแตนด์บาย (standby site) และบริเวณว่าง (spacer region) ของ RBS จากนั้น คัดเลือกสายพันธุ์ E. coli ที่มีการดัดแปลง RBS และโอเพอรอน phaCAB .ให้สามารถผลิต PHB ใน ปริมาณสูงได้โดยกระบวนการคัดเลือกนั้นจะคัดเลือกบนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็ง LB และจานเพาะเลี้ยง เชื้อขนาด 96 หลุมที่มีกลูโคเเป็นแหล่งคาร์บอนและไนล์เรดเป็นตัวตรวจวัด โดยจะคัดเลือกโคโลนีที่มี ค่าฟลูออเรสเซ็นสูง 14 โคโลนีไปทดสอบการผลิต PHB เบื้องต้นด้วยการเพาะเลี้ยงระดับขวดเขย่า จากนั้นผู้วิจัยได้คัดเลือกโคโลนีที่มีอัตราการเจริญจำเพาะและอัตราการผลิตภัณฑ์จำ เพาะที่สูง และปานกลางไปศึกษาการเจริญของรีคอมบิแนนท์ E. coli ผลจากการทดลองพบว่า โคโลนีที่ 20 สามารถผลิต PHB ได้สูงที่สุดเท่ากับ 60.91% ของน้ำหนักเซลล์แห้งคิดเป็นปริมาณ PHB เท่ากับ 4.02 กรัมต่อลิตร ขณะที่สายพันธุ์ที่ใช้เป็นตัวควบคุมสามารถผลิต PHB ได้เท่ากับ 26.98% ของน้ำหนักเซลล์ แห้งคิดเป็นปริมาณ PHB เท่ากับ 0.054 กรัมต่อลิตร ดังนั้นในงานวิจัยนี้แสดงให้เห็นถึงการใช้ โปรโมเตอร์ BBa_J23100 ร่วมกับการดัดแปลง RBS ในรีคอมบิแนนท์ E. coli สามารถเพิ่ม ประสิทธิภาพของการผลิต PHB และสามารถนำไปหาสภาวะที่เหมาะสมของการผลิต PHB ในระดับที่ สูงขึ้นในอนาคตได้
Other Abstract:	Production of biodegradable plastic poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) in E. coli by PHB biosynthesis genes, phaCAB operon, has offered advantages over the wild type strains such as high growth rate, cheap medium, high productivity including an absence of depolymerase enzyme. Typically, phaCAB operon could be expressed under the control of promoter and ribosome binding site region (RBS). Normally, the promoter is an inducible promoter that has to use inducing agents (i.e. Isopropyl β-d-1- thiogalactopyranoside; IPTG) that would increase the cost of production. The objective of this study was to use strong constitutive promoter BBa_J23100 to replace inducible promoter and construct a library of RBS by degenerated primers in standby site and spacer region of RBS. Next, the recombinant E. coli harboring modified RBS and phaCAB operon were screened for high efficiency of PHB production. The screening process was performed using both LB agar plates and 96 well plates containing glucose as a carbon source and Nile red as an indicator. We selected 14 colonies with having high fluorescence unit for preliminary PHB production in flask cultivation. Then, we selected the colonies to have high and moderate specific growth rates and specific production rates to characterize the PHB time course production. As a result, the colony namely #20 showed the highest PHB production of 60.91 % (w/w) with PHB 4.02 g/L whereas the control strain showed PHB production of 26.98% (w/w) with 0.054 g/L. Therefore, in combination with BBa_J23100 and modified RBS performed in this study, we successfully obtained the recombinant E. coli that showed high efficiency of PHB production. The further optimization in large scale production of PHB using these recombinants is required.
Description:	โครงงานเป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ปีการศึกษา 2563
URI:	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/78851
Type:	Senior Project
Appears in Collections:	Sci - Senior Projects

Files in This Item:

File	Description	Size	Format
63-SP-MICRO-006 - Thanate Srimora.pdf		51.36 MB	Adobe PDF	View/Open

Show full item record