การพัฒนาเทคนิค Multiplex allele-specific recombinase polymerase amplification with dipstick chromatography (MAS-RPA-DC) ในการวินิจฉัยการดื้อยา Rifampicin ของเชื้อ Mycobacterium tuberculosis

Abstract

วัณโรคดื้อยาหลายขนาน (Multidrug-resistant tuberculosis: MDR-TB) เป็นหนึ่งในสาเหตุหลักที่ทำให้การรักษาวัณโรคล้มเหลว และส่งผลให้การแพร่ระบาดของโรคยังคงมีอัตราที่สูง วัณโรคดื้อยาหลายขนานเกิดจากเชื้อ Mycobacterium tuberculosis ที่ดื้อต่อยา Rifampicin และยา Isoniazid พร้อมกัน โดยมากกว่า 90% ของวัณโรคที่ดื้อยา Rifampicin มักเกิดการดื้อยา Isoniazid ร่วมด้วยภายหลัง ดังนั้นการตรวจวินิจฉัยการดื้อยา Rifampicin ของเชื้อ M. tuberculosis จึงสามารถใช้เป็นตัวแทนในการตรวจหาวัณโรคดื้อยาหลายขนานได้ วิธีทางอณูชีววิทยาที่ใช้วินิจฉัยวัณโรคดื้อยาหลายขนานในปัจจุบันต้องอาศัยเครื่องมือที่มีราคาแพงและการดูแลซ่อมบำรุงอย่างสม่ำเสมอ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมภายใต้อุณหภูมิคงที่ได้เข้ามามีบทบาทอย่างมากในการวินิจฉัยโรคทางห้องปฏิบัติการและเป็นทางเลือกสำหรับการทดสอบที่ไม่ต้องอาศัยเครื่องมือที่จำเพาะ สามารถให้ผลการทดสอบที่ถูกต้อง รวดเร็ว และนำไปประยุกต์ใช้ ณ งานภาคสนามได้ การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาเทคนิค Multiplex allele-specific recombinase polymerase amplification ร่วมกับ dipstick chromatography (MAS-RPA-DC) สำหรับตรวจหาการกลายพันธุ์ภายในยีน rpoB ณ ตำแหน่งโคดอน 516 526 และ 531 ซึ่งสัมพันธ์กับการดื้อยา Rifampicin ของเชื้อ M. tuberculosis ในการทดสอบภายใต้ปฏิกิริยาเดียวกันและแบบอ่านผลด้วยตาเปล่า ภายหลังนำเทคนิค MAS-RPA-DC มาทดสอบกับ DNA ที่สกัดได้จากโคโลนีของเชื้อ M. tuberculosis สายพันธุ์คลินิกจำนวน 141 ตัวอย่าง พบว่าเทคนิค MAS-RPA-DC มีความไวและความจำเพาะที่สูงเมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิค Sanger DNA sequencing โดยมีความไวในการตรวจการกลายพันธุ์ของยีน rpoB516 rpoB526 และ rpoB531 มีค่าเท่ากับ 100 % 70 % และ 98.2 % ตามลำดับ มีค่าความจำเพาะในการตรวจการกลายพันธุ์ของยีน rpoB516 rpoB526 และ rpoB531 เท่ากับ 95.5 % 97.5 % และ 97.7 % ตามลำดับ และมีความสอดคล้องอยู่ในระดับดีถึงดีมาก เมื่อเปรียบเทียบกับผลการทดสอบความไวต่อยา Rifampicin ด้วยวิธีฟีโนไทป์ของเชื้อจำนวน 125 ตัวอย่าง พบว่าเทคนิค MAS-RPA-DC มีความไวและความจำเพาะเท่ากับ 83.2 % และ 100 % ตามลำดับ และมีความสอดคล้องอยู่ในระดับดี เทคนิค MAS-RPA-DC มีความเข้มข้นน้อยที่สุดที่สามารถทดสอบได้เท่ากับ 1 ng/µl และไม่เกิดปฏิกิริยาข้ามกลุ่มกับเชื้อแบคทีเรียสายพันธุ์ที่มักพบในการก่อโรคทางเดินหายใจ เทคนิค MAS-RPA-DC สามารถนำไปศึกษาต่อเพื่อพัฒนาเป็นชุดตรวจวัณโรคดื้อยาหลายขนาน และเหมาะสำหรับใช้ในงานภาคสนามหรือโรงพยาบาลขนาดเล็ก เนื่องจากไม่จำเป็นต้องอาศัยเครื่องมือที่จำเพาะที่มีราคาแพง และยังเป็นเทคนิคที่มีความรวดเร็ว อ่านผลปฏิกิริยาแบบ Multiplex ได้ด้วยตาเปล่า ไม่ซับซ้อน ราคาถูก มีความไวและความจำเพาะสูง