การแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนหนามของ SARS-CoV-2 เพื่อการพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัย COVID-19

Abstract

โรคโควิด-19 เป็นโรคติดต่อทางระบบทางเดินหายใจที่เกิดจากเชื้อไวรัสโคโรนาสายพันธุ์กลุ่มโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (SARS-CoV-2 : Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) ไวรัส SARS-CoV- 2 ติดเชื้อบริเวณทางเดินหายใจส่วนล่างของมนุษย์โดยอาศัยการจับกันของโปรตีนหนาม (Spike) ที่ ประกอบด้วยหน่วยย่อย S1 และ S2 โดย S1 โครงสร้างที่สำคัญที่มี RBD (Receptor binding domain) ซึ่งมีความจำเพาะในการจับกับ Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor ของมนุษย์เพื่อเข้าสู่เซลล์สามารถติดต่อผ่านการสัมผัสกับผู้ติดเชื้อ ผ่านละอองเสมหะจากการไอ จาม น้ำมูก น้ำลาย ทำให้มีการแพร่ระบาดเป็นวงกว้างจนองค์การอนามัยโลกประกาศให้เป็นการระบาดระดับ “Pandemic” เนื่องด้วย COVID-19 เป็นโรคอุบัติใหม่การพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัย พัฒนาวัคซีนมีความจำเป็นในการควบคุมการระบาด แต่การจะใช้ไวรัสเชื้อเป็น (live virus) ต้องอาศัยห้องปฏิบัติการที่มีระบบความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 3 (biosafety level III) ดังนั้น การใช้โปรตีนโครงสร้างของไวรัส SARS-CoV-2 จะเป็นหนึ่งในทางเลือกทำให้การพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัยและวัคซีนสามารถดำเนินไปได้สะดวกรวดเร็วยิ่งขึ้น ในงานวิจัยนี้จึงศึกษาการแสดงออกของโปรตีนหนามโดยอาศัยพลาสมิด 4 ชนิด ได้แก่ pCI neo stabilized spike, pCI neo RBD, pCMV S1, pCMV RBD ซึ่งถูกแปลรหัสเป็นโปรตีน 2 ชนิด คือ Spike และ RBD มีขนาดประมาณ 200 และ 27 kDa (kilodalton) ตามลำดับ โดยนำพลาสมิดเข้าสู่ cell line 2 ชนิด ได้แก่ CHO-K1และ HEK293 ซึ่งนำเข้าเซลล์แบบชั่วคราวโดยใช้ Fugene HD เพื่อทดสอบความสามารถในการแสดงออกโปรตีนแต่ละตัว พบว่ามีเพียง HEK293 ที่สามารถแสดงออกโปรตีนจากพลาสมิด pCI neo stabilized spike และ pCI neo RBD จึงทำการคัดเลือกเซลล์ HEK293 ที่มีพลาสมิดโดยใช้ยา G418 (Geneticin) จากนั้นนำโปรตีนไปทำให้บริสุทธิ์ (purification) โดยวิธี affinity chromatography และตรวจสอบด้วย SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) และ Western blot ซึ่งใช้ α His tag rabbit mAb เป็นแอนติบอดีปฐมภูมิ ซึ่งการศึกษาเพิ่มเติมด้วยการทำ ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) โดยทำการทดลองกับเลือดผู้ป่วยที่หายจากโรคจะสามารถตรวจสอบความสามารถในการจับกับ antibody และนำไปสู่การพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัย COVID-19 ต่อไป