การพัฒนาเทคนิคระดับโมเลกุลเพื่อการจำแนกสายพันธุ์ Listeria innocua โดย High Resolution Melting Analysis

Abstract

Listeria innocua เป็น Listeria สปีชีส์ที่พบว่ามีการปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์เนื้อสัตว์ปรุงสุกและอาหารพร้อมบริโภคค่อนข้างมากจึงเป็นปัญหาในการส่งออกผลิตภัณฑ์ดังกล่าว แม้ว่าประเทศผู้นำเข้า เช่น สหรัฐอเมริกาและประเทศญี่ปุ่นจะกำหนดเกณฑ์มาตรฐานทางจุลินทรีย์เฉพาะ L. monocytogenes แต่เนื่องจากผู้นำเข้าในสหภาพยุโรปได้กำหนดไม่ให้พบ Listeria ทุกสปีชีส์ซึ่งรวมถึง L. innocua ดังนั้นจึงมีความจำเป็นต้องควบคุมไม่ให้มีการปนเปื้อน Listeria spp. ในผลิตภัณฑ์ มีงานวิจัยหลายฉบับรายงานว่า L. innocua มักจะปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์และสิ่งแวดล้อมของกระบวนการผลิต ดังนั้นการศึกษาเส้นทางการปนเปื้อนของ L. innocua จากสิ่งแวดล้อมของกระบวนการผลิตสู่ผลิตภัณฑ์จึงเป็นสิ่งที่จำเป็นในการควบคุมและป้องกันการปนเปื้อนของ L. innocua เข้าสู่ผลิตภัณฑ์อาหาร ปัจจุบันมีงานวิจัยที่ใช้เทคนิคระดับโมเลกุลหลายวิธีในการตรวจติดตามแหล่งการปนเปื้อนของแบคทีเรียในอาหาร การวิเคราะห์ความแตกต่างที่บริเวณตำแหน่ง Tandem Repeat (TR) ภายในจีโนมของแบคทีเรียเป็นเทคนิคระดับโมเลกุลที่ใช้ในการจำแนกสายพันธุ์แบคทีเรียหลายชนิดและพบว่ามีความสามารถในการจำแนกสายพันธุ์สูงกว่าเทคนิคอื่นๆ แต่จำเป็นต้องใช้ Capillary Electrophoresis (CE) ซึ่งมีค่าใช้จ่ายสูงในการวิเคราะห์ขนาดของชิ้นดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงได้พัฒนาเทคนิค High Resolution Melting Analysis (HRM) เพื่อวิเคราะห์ความแตกต่างที่บริเวณตำแหน่ง TR ของ L. innocua เพื่อใช้ในการการจำแนกสายพันธุ์ L. innocua จำนวน 93 ไอโซเลทที่แยกได้จากผลิตภัณฑ์และสิ่งแวดล้อมภายในโรงงานผลิตไก่ปรุงสุกแช่เยือกแข็งในโรงงานแห่งหนึ่ง ในขั้นแรกได้ใช้โปรแกรม Unipro UGENE ในการค้นหาตำแหน่ง TR ภายในจีโนมของ L. innocua และได้คัดเลือก TR 13 ตำแหน่งที่มีนิวคลีโอไทด์ซ้ำกันเป็นชุดอย่างน้อย 5 นิวคลีโอไทด์เพื่อใช้ในการวิเคราะห์ความแตกต่างด้วย CE และเทคนิค HRM จากนั้นออกแบบไพรเมอร์สำหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอบริเวณตำแหน่ง TR ด้วยโปรแกรม Primer3 การพัฒนาเทคนิค HRM เริ่มจากการทดสอบการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอที่ตำแหน่ง TR โดยได้เลือก L. innocua 11 ไอโซเลทจากแหล่งต่างๆกันภายในโรงงานผลิตไก่ปรุงสุกแช่เยือกแข็ง มาเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอที่ตำแหน่ง TR ทั้ง 13 ตำแหน่งด้วยไพรเมอร์ 13 คู่โดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส ตรวจสอบผลิตภัณฑ์ที่ได้จากปฏิกิริยาและวิเคราะห์ขนาดของชิ้นดีเอ็นเอโดย CE สำหรับตำแหน่ง TR ที่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ จะนำมาวิเคราะห์ความเป็นไปได้ในการจำแนกความแตกต่างบริเวณตำแหน่ง TR ด้วยเทคนิค HRM พบว่า ไพรเมอร์ 8 คู่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของทั้ง 11ไอโซเลทได้ที่ตำแหน่ง TR1, TR2, TR3, TR5, TR6, TR10, TR12 และ TR13 ซึ่งผลการวิเคราะห์ขนาดชิ้นดีเอ็นเอด้วย CE สอดคล้องกับผลการวิเคราะห์ด้วย HRM ในทุกตำแหน่ง ยกเว้นตำแหน่ง TR5 และ TR13 ที่มีการเปลี่ยนแปลงของนิวคลีโอไทด์บริเวณ TR ในบางไอโซเลท ซึ่ง CE ไม่สามารถจำแนกความแตกต่างของนิวคลีโอไทด์ที่แตกต่างกันได้ ในขณะที่เทคนิค HRM นั้นสามารถจำแนกได้โดยให้รูปแบบของ melting profile ที่แตกต่างกัน ในขั้นต่อมา จำแนกความแตกต่างของขนาดชิ้นดีเอ็นเอของ L. innocua ทั้ง 93 ไอโซเลทที่ตำแหน่ง TR ทั้ง 8 ตำแหน่งด้วย CE แล้ววิเคราะห์ความแตกต่างบริเวณ TR ด้วยเทคนิค HRM พบว่า ที่ตำแหน่ง TR1, TR3, TR6 และ TR13 มีความแตกต่างของขนาดชิ้นดีเอ็นเอและมีรูปแบบ melting profile จากการวิเคราะห์ด้วยเทคนิค HRM เป็น 2, 6, 4, และ 6 รูปแบบที่ตำแหน่ง TR1, TR3, TR6 และ TR13 ตามลำดับ ในขณะที่ตำแหน่ง TR2, TR5, TR10 และ TR12 ไม่มีความแตกต่างของ TR ใน 93 ไอโซเลทที่ใช้ทดสอบ ซึ่งเทคนิค HRM สามารถจำแนกไอโซเลทที่มีขนาดชิ้นดีเอ็นเอแตกต่างกันออกจากกันและจัดกลุ่มไอโซเลทที่มีขนาดชิ้นดีเอ็นเอเท่ากันไว้ด้วยกันได้อย่างถูกต้องในทุกตำแหน่ง โดยมีข้อยกเว้นในไอโซเลทที่เกิดการเปลี่ยนแปลงของนิวคลีโอไทด์ในตำแหน่ง TR5 และ TR13 การประเมินความแม่นยำของเทคนิคโดยการทดสอบความสามารถในการวิเคราะห์ซ้ำ พบว่า เทคนิค HRM มีความสามารถในการวิเคราะห์ซ้ำภายในครั้งเดียวกันและวันที่ต่างกันในทุกตำแหน่ง การจำแนกสายพันธุ์ L. innocua โดยการวิเคราะห์ความแตกต่างบริเวณตำแหน่ง TR ด้วย CE และเทคนิค HRM สามารถจำแนก L. innocua 93 ไอโซเลทได้เป็น 10 จีโนไทป์และมีค่า Discriminatory index เป็น 0.45 โดยสามารถเชื่อมโยงสายพันธุ์ที่ปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์และสิ่งแวดล้อมภายในบริเวณผลิตได้ สรุปได้ว่าเทคนิค HRM เป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพในการจำแนกสายพันธุ์ L. innocua โดยการวิเคราะห์ความแตกต่างบริเวณ TR และสามารถใช้ทดแทนการวิเคราะห์ด้วย CE โดยให้ผลการวิเคราะห์ที่สอดคล้องกับ CE จึงเป็นเทคนิคที่สามารถนำไปใช้ติดตามสายพันธุ์ของ L. innocua ที่ปนเปื้อนในอุตสาหกรรมอาหารได้