Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/53383
| Title: | การปรับปรุงสายพันธุ์ Escherichia coli เพื่อผลิตกรดแลกติกด้วยเทคนิคทางพันธุศาสตร์โมเลกุล |
| Other Titles: | Improvement of lactic acid production in Escherichia coli by using molecular genetic techniques |
| Authors: | ฤทัยรัตน์ บุญสมบัติ |
| Email: | a_cnn@yahoo.com |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สถาบันวิจัยเทคโนโลยีชีวภาพและวิศวกรรมพันธุศาสตร์ |
| Subjects: | กรดแล็กติก เอสเคอริเคียโคไล แบคทีเรียกรดแล็กติก--พันธุศาสตร์ |
| Issue Date: | 2556 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | กรดแลกติกมีการนำไปใช้ในอุตสาหกรรมอย่างกว้างขวางรวมถึงความเป็นไปได้ในการใช้เป็น สารตั้งต้นเพื่อผลิตพลาสติกที่ย่อยสลายได้ทางชีวภาพ โดยกระบวนการผลิตกรดแลกติกบริสุทธิ์ที่มี ประสิทธิภาพมีความสำคัญอย่างยิ่งสำหรับการนำไปใช้เพื่อการสร้างสายพอลิเมอร์ เมื่อการตัดต่อยีน ldhAจาก Rhizopus oryzae เข้าสู่พลาสมิด แล้วนำเข้าสู่ Esherichia coli ที่ยีน ldhAบนดีเอ็นเอถูกทำลาย เกิดเป็น E. coli สายพันธุ์ RB24 พบว่ายีน ldhAของ R. oryzae บนพลาสมิดสามารถแสดงออกได้ โดย เมื่อทำการหมักในอาหารที่มีกลูโคสเริ่มต้น 100 g/L ในภาวะที่ไม่มีออกซิเจนและไม่เติม Ampicilin พบว่า E. coli สายพันธุ์นี้สามารถผลิตกรดแลกติกไอโซเมอร์ L ได้มากที่สุด แต่เนื่องจากปริมาณกรด แลกติกที่ผลิตได้ยังมีปริมาณน้อยซึ่งอาจเป็นผลมาจากกลูโคสที่เหลือในอาหารเลี้ยงเชื้อมีปริมาณมากทำ ให้ไปยับยั้งการผลิตกรดแลกติกและการสูญเสียพลาสมิดได้ง่ายเมื่อไม่เติม Ampicilin จึงได้ทำการหา ภาวะที่เหมาะสมในการหมัก E. coli สายพันธุ์ RB24 คือในขั้น Pre-culture ใช้ภาวะที่มีออกซิเจนเพื่อ เพิ่มจำนวนเซลล์ แล้วจึงทำการหมักในภาวะที่ไม่มีออกซิเจนโดยใช้กลูโคสเริ่มต้น 20 g/L และเติม Ampicilin ทำให้ได้ปริมาณกรดแลกติกที่คงที่มากขึ้นเมื่อทำการศึกษาการใช้เทคนิค error-prone PCR เพื่อทำให้บริเวณยีน ldhAจาก R. oryzae บนพลาสมิดเกิดการกลายพันธุ์แบบสุ่ม พบว่าสามารถคัดเลือก E. coli สายพันธุ์ที่ผลิตกรดแลกติกได้ดีขึ้นกว่า E. coli สายพันธุ์ RB24 ประมาณ 7 เท่า โดยพบการ เปลี่ยนแปลงลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ตำแหน่ง 94 และ 204 หลัง Stop codon จาก G เป็น T ทั้งสองตำแหน่ง ในสายพันธุ์ที่ตั้งชื่อว่าสายพันธุ์ TW4 นอกจากนี้ยังพบว่า E. coli สายพันธุ์ TW4 สามารถผลิตกรดแลก ติกไอโซเมอร์ L ได้ดีที่สุดในอาหารหมักที่มีกลูโคสเริ่มต้น 20 g/L |
| Other Abstract: | Lactic acid is widely applied in various industries including the use as a potential precursor for biodegradable plastics. The effective process to produce optically pure monomers of lactic acid is essential for further polymer synthesis. When plasmid with ldhA from Rhizopus oryzae was transformed into E. coliof which chromosomal ldhA was knocked out, generating the strain called RB24, R. oryzae ldhA gene on the plasmid could be expressed. TheRB24 produced L-lactic acid with the highest yield when fermented with fermentation broth containing 100 g/L intial glucose without Ampicillin under anaerobic condition. However, the lactic acid yield obtained from this strain was still low that may result from the inhibition of the lactic acid production by high amount of residual glucose in the culture and the easy loss of plasmid when Ampicillin was not added. To solve this problem, the suitable condition for fermenting E. coli strain RB24 was optimized and found that Llactic acid production was more stable when the strain was pre-cultured under aerobic condition to increase cell density for the inoculum and further fermented with fermentation broth containing 20 g/L intial glucose with Ampicillin addition under anaerobic condition. When error-prone PCR was applied to generate random mutations on R. oryzae ldhA gene region, which further inserted on plasmid and transformed into E. coli, the selected clone could produce L-lactic acid approximately 7 times more than RB24 strain. DNA sequencing suggested that, in the strain named TW4, there were 2 point mutations from G to T at both of 94th and 204th positions which were located downstream the stop codon. Furthermore, the strain TW4 could produce L-lactic acid with the highest yield by using fermentation broth with 20 g/L initial glucose. |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/53383 |
| Type: | Technical Report |
| Appears in Collections: | Biotec - Research Reports |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Ruethairat_bo_2556.pdf | 1.08 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.