Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/6362
Full metadata record
DC FieldValueLanguage
dc.contributor.advisorAran Incharoensakdi-
dc.contributor.advisorTakabe, Teruhiro-
dc.contributor.authorSurasak Laloknam-
dc.contributor.otherChulalongkorn University. Faculty of Science-
dc.date.accessioned2008-03-24T03:37:14Z-
dc.date.available2008-03-24T03:37:14Z-
dc.date.issued2005-
dc.identifier.isbn9741421575-
dc.identifier.urihttp://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/6362-
dc.descriptionThesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2005en
dc.description.abstractA halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophytica grown under various NaCI concentrations from 0.5-3.0 M and pH from 6.5-10.5 showed optimal NaCI concentration and optimal pH for cell growth at 0.5 M NaCI and pH9.5, respectively. We examined the relationships between cell growth, cell size, intracellular solute, amino acid composition, and protein profiles as affected by salt stress. Cell growth was reduced when NaCI was increased while cell size was increased with high accumulation of glycine betaine. Ion contents Na[superscript+], NH[subscript4][superscript+], and NO[subscript3][superscript-] were not so much different under non stress and salt stress conditions. Amino acid gluamine was the major amino acid under both conditions and analysis showed that glutamine, aspartate, proline, and glutamate increased under salt stress condition. Salt stress induced apparent proteins from all fractions, cytoplasmic, periplasmic, and membranc, and membrance fraction as determine by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. The highest intensity band was observed in cytoplasmic, periplasmic, and membrance farction showing molecular mass of 32.0, 35.5 and 41.5 kDa, respectively. Membrance fractions showed highest choline binding activity which was strongly inhibited by glycine betaine, glycine betaine aldehyde, and carnitine, respectively when studied by using non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis autoradiograph, radio protein precipitation, and surface plasmon resonance, respectively. Uptake of [methyl-[superscript14]C] choline into intact cells and membrance vesicles of A. halophytica was studied. The apparent choline uptake for intact cells revealed k[subscriptm] values of non-stress condition at 1.0 M and 2.0 M NaCI to be 246.78, 262.19, and 299.51 muM, respectively, V[subscriptmax] were 12.12, 24.10, and 10.71 nmo/min/mg protein, respectively. The apparent choline uptake for membrance vesicles revealed K[subscriptm] values of non stress (0.5 M NaCI) and salt stress condition (2.0 M NaCI) to be 82.00 and 88.11 muM , respectively and V[subscriptmax] were 4.55 and 1.82 nmol/min/mg protein, respectively. Glycine betaine and glycine betance aldehyded caused completed caused complete inhibition of choline uptake at salt stress condition. Intact cells and membrance vesicles of the halotolerant cyanobacterium A. halophytica were investigated for energetics of choline transport. Both intact cells and membrance vesicles showed almost similar results. Choline uptake was completely ingibited by carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone and 2, 4 -dinitorphenol suggesting that choline uptake was driven by proton motive force. An artificially-generated pH gradient across the members (triangle pH) caused an increase of choline uptake. In contrast, the suppression of trianglepH resulted in a decrease of choline uptake. The increase of external pH also resulted. in an enhancement of cholin uptake. The generation of the electrial across the membrane (triangle psi) resulted in no elevation of the rate of choline uptake. On the other hand, the valinomycin-mediated dissipation of triangle psi caused no depression of the rate of choline uptake. Thus, it is unlikely that triangle psi participated in the energization of the uptade of choline. Choline transport was completely inhibited by nigericin (dissipate proton gradient) suggesting that choline uptake depended on proton gradient. However, Na[superscript+-gradient across the membrance was suggested to play a role in choline uptake since monensin and amiloride, which collapses Na[superscript+-gradient strongly choline uptake. To study the energetics for nitrate transport of A. halophytica showed similar results to choline transport into cells. Since initial search for choline transporter gene in A. Halophytica failed to identify the gene, we then resorted to clone and characteriz a betaine transporter gene (Ap-betT) and found that it exhibited high homology to betaine transporters from Bacillus subtilis OpuD, but low homologies to betaine/proline transporters from betaine accumlating plants. After heterologous expression of Ap-betT in E. coli mutant strain MKH13, which lacks choline, betaine, and proline transport systems, only betaine uptake was restored. Sodium, but not potassium markedly enhanced betaine uptake rates, suggesting that ApBetT is a Na[superscript+ -betaine symporter. Betaine uptake activities of Ap-BetT were high at alkaline pH with the optimum pH around 9.0. The Synechococcus cells overexpressing ApBetT exhibited betaine uptake and enhanced salt tolerance to the extent that the freshwater cyanobacterium could grow in sea water when betaine was included in the growth medium. Kinetic properties of betaine uptake in the Synechococcus cells overexpressing ApBet were similar to those in Aphanothece halophytica cells. These findings indicate that A. halophytica contains a Na[superscript+]-betaine symporter that contributes to the salt stress tolerance at alkaline pH.en
dc.description.abstractalternativeสาหร่ายสีเขียวแกมน้ำเงินทนเค็ม Aphanothece halophytica เจริญภายใต้ภาวะที่มีความเครียดของเกลือโซเดียมคลอไรด์ 0.5-3.0 โมลาร์ พีเอช 6.5-10.5 พบว่าเซลล์เจริญได้ดีที่ความเข้มข้นเกลือโซเดียมคลอไรด์ 0.5 โมลาร์ และพีเอช 9.5 ตามลำดับ ศึกษาความสัมพันธ์ของการเจริญของเซลล์ ขนาดของเซลล์ สารประกอบภายในเซลล์ องค์ประกอบของกรดอะมิโน และรูปแบบของโปรตีนภายใต้ภาวะทีมีความเครียดของเกลือ พบว่า การเจริญของเซลล์ลดลงเมื่อความเข้มข้นของเกลือโซเดียมคลอไรด์เพิ่มขึ้น ภายใต้ภาวะที่มีความเครียดของเกลือ พบว่า เซลล์มีขนาดเพิ่มขึ้น มีการสะสมไกลซีนบีเทนเพิ่มขึ้น และอิออนโซเดียม โปแตสเซียม แอมโมเนีย และไนเตรต มีการเปลี่ยสแปลงอย่างไม่เด่นชัด เมื่อเปรียบเทียบกับภาวะที่ไม่มีความเครียดจากเกลือ กลูตามีนเป็นกรดอะมิโนที่พบมากที่สุดทั้งสองภาวะ และพบกรดอะมิโนกลูตามีนแอสปาเตต โปรลีน และกลูตาเมต เพิ่มขึ้นภายใต้ภาวะที่มีความเครียดของเกลือ ภาวะที่มีความเครียดของเกลือชักนำให้เกิดแถบโปตีนเพิ่มขึ้นในแฟรกชั่น ไซโตปลาสซึม เพอริปลาสซึม และเมมเบรน เมื่อทำการวิเคราะห์ด้วย โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต พอลิอะคริลิไมค์เจล แถบโปรตีนที่มีความเข้มข้นสูงสุดของแฟรกชั่น ไซโตปลาสซึม เพอริปลาสซึม และเมมเบรน มีมวลโมเลกุล 32.0, 35.5, และ41.5 กิโลดาลตัน ตามลำดับ แฟรกชันเมมเบรนมีสมบัติเป็นโปรตีนที่จับกัลโคลีนได้และถูกยับยั้งสมบัติโปรตีนที่จับโคลีนกับแมมเบรนได้ด้วย ไกลซีนบีเทน ไกลซีนบีเทนอัลดีไฮด์ และคาร์นิทีน ตามลำดับ เมื่อทำการศึกษาโดยเทคนิก พอลิอะคริลิไมค์เจล อิเล็กโตรพอลิซิส แบบไม่เสถึยรสภาพ ตามด้วย ออโตเรดิโอกราฟ การตกตะกอนโปรตีนที่มีสารรังสี และเซอร์เฟสพลาสมอนเรโซแนนซ์ ทำการศึกษาจลนพลศาสตร์การนำเข้าโคลีนเข้าสู่เซลล์ และ เมมเบรน เวซิเคิล ของ A. halophytica ที่ภาวะปกติ และภาวะที่มีความเครียดของเกลือ 1.0 โมลาร์ และ2.0 โมลาร์ มีค่าK[subscritp m] = 246.78, 262.19, และ299.51 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ และอัตราเร็วสูงสุด V[subscript mx] เป็น 12.12, 24.10, และ 10.71 nmol/min/mg/ protein, ตามลำดับ การนำโคลีนเข้าสู่เมมเบรน เวซิเคิล พบว่าที่ภาวะปกติโซเดียมคลอไรด์ความเข้มข้น 0.5 โมลาร์ และภาวะที่มีความเครียดของเกลือโซเดียมคลอไรด์ 2.0 โมลาร์ มีค่า K[subscript m] = 82.00 และ 88.11 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ และอัตราเร็วสูงสุด V[subscript mx] เป็น4.55 และ 1.82 nmo/min/mg protein ตามลำดับ ที่ภาวะที่มีความเครียดของเกลือ ไกลซีนบีเทนและ ไกลซีนบีเทนอัลดีไฮด์ยับยั้งการนำเข้าโคลีนได้อย่างสมบูรณ์ เมื่อทำการศึกษาพลังงานที่จำเป็นในการนำโคลีนเข้าสู่เซลล์ และ เมมเบรนเวซิเคิล ของ สาหร่ายสีเขียวแกมน้ำเงินทนเค็ม A. holophytica พบว่าผลการทดลองที่ทำทั้งสองมีความคล้ายกัน การนำเข้าโคลีนยับยั้งได้อย่างสมบูรณ์ด้วย คาร์บอนิล ไซยาไนด์ เอ็ม คลอโรฟีนิล ไฮดราโซน และ 2, 4 ไดไนโตรฟีนอล อธิบายได้ว่าการนำเข้าโคลีนขับเคลื่อนโดยโปรตอนโมทีฟฟอร์ซ การศึกษาด้วยการสร้างความต่างศักย์ของความเป็นกรด-ด่าง ระหว่างเมมเบรน ([delta]pH) พบว่าเพิ่มการนำเข้าโคลีน เมื่อทำการลดความต่างศักย์ของความเป็นกรด-ด่าง ระหว่างเมมเบรน ([delta]pH) พบว่าการนำเข้าโคลีนลดลง และเมื่อพีเอชภายนอกเพิ่มขึ้น การนำเข้าโคลีนก็เพิ่มขึ้นเช่นกัน เมื่อทำการเพิ่มศักย์ของเมมเบรนอันเนื่องมาจากประจุ ([delta][psi]) ไม่มีผลต่อการนำเข้าโคลีน เมื่อทำการศึกษาการลดความต่างศักย์ของเมมเบรนอันเนื่องมาจากประจุ ([delta][psi]) ด้วยการใช้วาลิโนไมซิน ไม่มีผลต่อการนำเข้าโคลีนเช่นกัน แต่เป็นส่วนหนึ่งที่ให้พลังงานในการนำเข้าโคลีน การนำเข้าโคลีนถูกยับยั้งอย่างสมบูรณ์ด้วย ไนเจอริซิน (ตัวยับยั้งความต่างศักย์ของเมมเบรนอันเนื่องมาจากโปรตอน) อธิบายได้ว่าการนำเข้าโคลีนขึ้นอยู่กับความต่างศักย์ของเมมเบรนอันเนื่องมาจากโปรตอน อย่างไรก็ตาม ความต่างศักย์อันเนื่องมาจากโซเดียมอิออนมีบทบาทในการนำเข้าโคลีน เพราะว่า โมเนนซิน และอะมิโลไรด์ (ตัวยับยั้งความต่างศักย์อันเนื่องมาจากโซเดียมอิออน) ยับยั้งการนำเข้าโคลีน และทำการศึกษาการนำไนเตรตเข้าสู่เซลล์ สาหร่ายสีเขียวแกมน้ำเงินทนเค็ม A. halophytica พบว่าผลการทดลองเหมือนกับการนำโคลีนเข้าสู่เซลล์ ทำการศึกษาสมบัติของยีนบีเทนทรานส์พอร์เตอร์ของ A. halophytica เนื่องจากไม่สามารถทำการแยกยีนที่เกี่ยวข้องกับการขนส่งโคลีนได้ พบว่ายีนบีเทนทรานส์พอร์เตอร์ของ A. halophytica มีความเหมือนสูงกับ OpuD ของ Bacillus subtilis และมีความเหมือนน้อยกับบีเทน/โปรลีนทรานส์พอร์เตอร์ที่พบในพืช จากนั้นทำการโคลนยีนของบีเทนทรานส์พอร์เตอร์ เข้าสู่ Escherichia coli MKHI3 ที่ไม่มียืนของระบบการขนส่ง โคลีน บีเทน และโปรลีน พบว่าสามารถทำให้ MKHI3 ที่มียีนบีเทนททรานส์พอร์เตอร์เจริญได้ในความเข้มข้นของเกลือสูงกว่าภาวะปกติและมีความจำเพาะต่อบีเทน และไม่นำเข้าโปรลีน พบว่า โคลีน จีเอบีเอ บีเทนอัลดีไฮด์ ซาร์โคซีน ไดเมทิลไกลซีน และกรดอะมิโน ไม่มีผลต่อการนำเข้าบีเทน โซเดียมอิออนเร่งการนำเข้าบีเทนโดยไม่เกี่ยวข้องกับโปแตสเซียมอิออน พีเอชที่เหมาะสมในการนำเข้าบีเทนคือ พีเอช 9 จากนั้นทำการโคลนเข้าสู่สาหร่ายสีเขียวแกมน้ำเงินน้ำจืดSyneccococcus พบว่าสามารถทำให้สาหร่ายสีเขียวแกมน้ำเงินน้ำจืดเจริญเติบโตได้ในน้ำเค็ม และกลไกทางจลนพลศาสตร์ของการนำบีเทนเข้าสู่เซลล์ Syneccococcus ที่มีบีเทน ทรานส์พอร์เตอร์คล้ายกับการนำบีเทนเข้าสู่เซลล์ A. halophytica จากการค้นพบนี้แสดงว่า A. halophytica มีโซเดียมอิออน-บีเทน ซิมพอร์เตอร์ที่ทนต่อภาวะเครียดของเกลือ และพีเอชที่เป็นด่างen
dc.format.extent2806473 bytes-
dc.format.mimetypeapplication/pdf-
dc.language.isoenes
dc.publisherChulalongkorn Universityen
dc.relation.urihttp://doi.org/10.14457/CU.the.2005.1778-
dc.rightsChulalongkorn Universityen
dc.subjectAphanothece halophyticaen
dc.subjectAlgae -- Growth-
dc.subjectMarine algae -- Growth-
dc.titleEffect of salt stress on choline transport into halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophyticaen
dc.title.alternativeผลของความเครียดจากเกลือต่อการขนส่งโคลีนเข้าสู่ไซยาโนแบคทีเรียทนเค็ม Aphanothece halophyticaen
dc.typeThesises
dc.degree.nameDoctor of Philosophyes
dc.degree.levelDoctoral Degreees
dc.degree.disciplineBiotechnologyes
dc.degree.grantorChulalongkorn Universityen
dc.email.advisoriaran@sc.chula.ac.th-
dc.email.advisorNo information provided-
dc.identifier.DOI10.14457/CU.the.2005.1778-
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
surasak.pdf2.74 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.