Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/69525
Title: Efficacy and safety evaluations of topical proretinal nanoparticles 
Other Titles: การประเมินประสิทธิศักย์และความปลอดภัยของอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอแบบทาเฉพาะที่
Authors: Benchaphorn Limcharoen
Advisors: Wijit Banlunara
Supason Wanichwecharungruang
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Veterinary Science
Issue Date: 2018
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Retinal (retinaldehyde) is one of natural vitamin A metabolites. It is widely used in clinical dermatology such as acne, acne scar, photoaging, wrinkles, psoriasis, skin neoplasia and seborrheic dermatitis. Retinal is a pivotal key to regulate keratinocyte proliferation and differentiation in the epidermis resulting in epidermal thickening and inhibit collagen destruction in the dermis. However, topical application of retinal is still irritative to the skin and chemically and photochemically unstable.  Topically applied retinal can induce a retinoid dermatitis. This inflammation is induced by an overload of non-physiological amounts of exogenous retinoic acid in the skin. The adverse effects and physicochemical stability of retinal limit its topical therapeutic effects in long-term treatment. To eliminate this dose-related side effect and the instability of the chemical, the developingment of topical nanoparticulate controlled-release drug delivery system as proretinal nanoparticles (PRN) which releases retinal continuously to prevent an excessive amount of retinal on the skin immediately after application has been proposed. The aims of this study were to investigate the safety, efficacy and biological activities of topical application of proretinal nanoparticles in term of follicular and intercellular penetration as the major pathways of topical nanoparticles in skin and to assess the possibility of the intradermal derlivery og PRN-loaded microneedle by non-invasive imaging techniques. In this study, proretinal nanoparticles had barely cytotoxic and apoptotic effects comparing with conventional retinal on exposure HaCaT cells, spontaneous immortalized keratinocytes, for 24 h. The biological activity of retinoid in PRN in HaCaT cells was investigated after 24 h exposure to PRN. CRABP-2, transporting protein for members of the vitamin A family to the cellular nucleus, was inducible and higher when compared with conventional at the same concentration of retinoids. To evaluate the safety and efficat aspects of PRN in vivo, daily topical application of PRN to rats for 28 consecutive days produced neither irritation nor inflammation but significantly increased of epidermal proliferation, epidermal thickness, CRABP-2 expression, and up-regulation of various differentiation markers of epidermis including keratin (K) 5, K10, K14, CRABP-2 ,and PCNA except IL-6, proinflammatory cytokine compared with topical applicaton of conventional retinal solution. Through the use of confocal laser scanning microscopy, we observed the in vivo follicular penetration of PRN with the depth of penetration independent of post-application time. As nanoparticles preferably penetrating the hair follicles, the follicular penetration depths of PRN at different time points were investigated further in ex vivo porcine skin. The release capacity of the nanoparticulate system was studied using fluorescein as a model drug. Additionally, the concentration of retinal in the stratum corneum and in the hair follicles was quantified after application in particulate and non-particulate form. The results showed that the nanocarriers reached the infundibular area of the hair follicles, irrespective of the incubation time. The nanoparticles were able to release their model drug within the hair follicle. The retinal concentration delivered to the stratum corneum and the hair follicles was significantly higher when retinal was applied in the particulate form. To assist the intradermal delivery of PRN for the dermal therapeutic aspect, the use of two combinations transdermal drug delivery strategies were developed as PRN and microneedle and then investigated by non-invasive imaging techniques as dermoscopy, optical coherence tomography and multiphoton microscopy. The localization and skin deposition of PRN localization in dermis has been studied and visualized successfully over the time following the application. The present study showed that topical application proretinal nanoparticles are safe, non-irritative, successfully penetrate into hair follicles and possess retinoid biological activities to skin as the ability to induct and regulate epidermal proliferation and differentiation. Finally, it could be beneficial in some retinoid-responsive skin conditions in the future. Although further investigations are necessary to clarify the required doses and dose intervals in clinical settings, the suggested system may help to overcome the main problems of topical retinoid therapy, which are skin irritation, chemical ,and photochemical instability and low bioavailability.  
Other Abstract: เรตินัลหรือเรตินัลดีไฮด์ (retinal หรือ retinaldehyde) เป็นหนึ่งในอนุพันธ์ตามธรรมชาติของวิตามินเอ ซึ่งเรตินัลในรูปแบบยาทาผิวหนังเฉพาะที่มีใช้อย่างแพร่หลายในทางการรักษาโรคผิวหนัง เช่น การรักษาสิวและหลุมสิว ใช้ในผลิตภัณฑ์ลดเลือนริ้วรอยฟื้นฟูอายุผิว โรคสะเก็ดเงิน เนื้องอกผิวหนังบางชนิด หรือการทำงานที่ผิดปกติของต่อมไขมัน โดยฤทธิ์ของวิตามินเอจะไปกระตุ้นการเจริญของเซลล์เคอราติโนไซต์แล้วทำให้ผิวหนังชั้นหนังกำพร้า (epidermis) หนาตัวขึ้น สามารถยับยั้งการสลายคอลลาเจน และกระตุ้นการสังเคราะห์คอลลาเจนใหม่ในชั้นหนังแท้ (dermis) แต่อย่างไรก็ตามคุณสมบัติทางเคมีกายภาพของเรตินัลและอนุพันธ์ของวิตามินเอนั้นไม่เสถียรสามารถโดนทำลายได้ง่าย ผลข้างเคียงจากการใช้เรตินัลและอนุพันธ์วิตามินเอแบบทาเฉพาะที่มักทำให้เกิดผิวหนังอักเสบแบบระคายเคือง เนื่องจากปริมาณในการทาเฉพาะแต่ละทีไม่คงที่ ผลข้างเคียงข้อจำกัดทั้งหมดนี้จำกัดผลของการรักษาของวิตามินเอแบบทาเฉพาะที่ในโรคผิวหนังต่าง ๆ ในระยะยาว เพื่อลดปัญหาเหล่านี้จึงมีการคิดค้นการนำส่งเรตินัลในรูปแบบเฉพาะที่ด้วยอนุภาคนาโนโดยเรียกว่าอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอ (proretinal nanoparticles; PRN) ช่วยเพิ่มความเสถียรให้เรตินัลรวมถึงมีคุณสมบัติในการควบคุมการปลดปล่อยเรตินัลอย่างช้า ๆ และต่อเนื่อง­ โดยวัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือ ศึกษาความเป็นพิษระดับเซลล์ของอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอกับฮาแคทเซลล์ในหลอดทดลอง ศึกษาฤทธิ์ของวิตามินตามธรรมชาติต่อฮาแคทเซลล์ (HaCaT) และต่อชั้นหนังกำพร้าในสัตว์ทดลอง ศึกษาความสามารถและปริมาณอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอในการส่งผ่านสารเข้าสู่ผิวหนังผ่านทางรูขุมขน (follicular penetration pathway) และผ่านทางระหว่างเซลล์คอร์นิโอไซต์ในชั้นสตราตัมคอร์เนียม (intercellular penetration pathway) ซึ่งอยู่บนสุดของหนังกำพร้า และสุดท้ายศึกษาความเป็นไปได้ของการนำส่งอนุภาคนาโนโปรวิตามินไปถึงชั้นหนังแท้โดยการใช้ไมโครนีดเดิ้ลช่วยในการนำส่งด้วยชิ้นส่วนผิวหนังสุกรซึ่งเป็นตัวแทนที่ดีของผิวหนังมนุษย์ การศึกษานี้เริ่มจากการศึกษาความปลอดภัยของอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอในหลอดทดลอง โดยใช้ฮาแคทเซลล์ซึ่งเป็นเคอราติโนไซต์เซลล์ไลน์โดยเป็นตัวแทนในการทดสอบของเซลล์เคอราติโนไซต์ซึ่งคือประชาการหลักของชั้นหนังกำพร้า โดยผลจากการศึกษาพบว่า อนุภาคนาโนโปรวิตามินเอมีความปลอดภัยต่อฮาแคทเซลล์โดยไม่เป็นพิษกับเซลล์และไม่เหนี่ยวนำการตายระดับเซลล์เมื่อทดสอบกับเซลล์ 24 ชั่วโมง และพบว่ามีการแสดงออกของโปรตีน CRABP-2 มากขึ้นเมื่อเทียบกับเซลล์กลุ่มควบคุมที่ทดสอบกับเรตินัล โปรตีน CRABP-2 นี้มีความสำคัญในแง่ของการกำหนดชีวปริมาณออกทธิ์ของวิตามินเอกับเซลล์ชั้นหนังกำพร้า หลังจากนั้นได้ทดสอบความปลอดภัยและประสิทธิศักย์ของอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอแบบทาเฉพาะที่ในผิวหนังของหนูแรท โดยทำการทาที่หลังของหนูทั้งหมด 28 วัน ศึกษาระดับความระคายเคืองของการทาอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอทุก 7 วันทั้งทางมหพยาธิวิทยาและจุลพยาธิวิทยา วัดความหนาของชั้นหนังกำพร้าโดยเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม จากการทดลองกลุ่มที่ทาอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอไม่พบการอักเสบระคายเคืองตลอดการทาที่หลังทั้งหมด 28 วัน  และอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอสามารถเข้าไปสู่รูขุมขนของหนูแรทได้โดยไม่ขึ้นกับระยะเวลาหลังจากทาบนผิวหนัง ในส่วนของการศึกษาการแสดงออกของโปรตีน 6 ชนิด คือ K5, K10, K14, PCNA, CRABP-2 และ IL-6 ด้วยวิธีอิมมูนโนฮีสโตเคมีที่แสดงออกที่ชั้นต่าง ๆ ของหนังกำพร้าหลังจากการทาอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอ เพื่อศึกษากลไกการควบคุมการเจริญของชั้นหนังกำพร้า พบว่าอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอให้ฤทธิ์ตามธรรมชาติที่ดีกว่าในชั้นหนังกำพร้า ในแง่ของการเพิ่มการหนาตัวของชั้นหนังกำพร้า การแสดงออกของโปรตีนที่ศึกษาข้างต้นเพิ่มมากขึ้นยกเว้น IL-6 ซึ่งสอดคล้องกับการที่ไม่พบการระคายเคืองและการอักเสบของผิวหนังตลอดการทาอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอ ส่วนการศึกษาปริมาณและความสามารถของอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอในการส่งเรตินัลเข้าสู่ผิวหนังผ่านทางรูขุมขนด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลเลเซอร์และผ่านทางระหว่างเซลล์คอร์นิโอไซต์ในชั้นสตราตัมคอร์เนียมบนผิวหนังสุกรด้วยเทคนิค tape stripping และ spectroscopy พบความสัมพันธ์ระดับความลึกในรูขุมขนของอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอและการปลดปล่อยเรตินัลจากอนุภาคนาโนโดยใช้สีฟลูออเรสเซนต์เป็นตัวแทนของเรตินัลนั้นไม่ขึ้นกับเวลา กล่าวคือระดับความลึกของการปลดปล่อยเรตินัลจากอนุภาคนาโนในรูขุมขนคงที่ตั้งแต่เริ่มทาลงไปที่ผิวหนัง เมื่อวัดปริมาณเรตินัลที่หลงเหลืออยู่ในชั้นสตราตัมคอร์เนียมชั้นบนสุดของหนังกำพร้าและในรูขุมขนพบว่าผิวหนังกลุ่มที่ทาอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอมีระดับเรตินัลที่มากกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ และการศึกษาสุดท้ายเมื่อใช้ไมโครนีดเดิ้ลที่มีอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอบรรจุอยู่ปักทะลุผ่านชั้นสตราตัมคอร์เนียมและหนังกำพร้าที่ผิวหนังสุกรด้วย dermpscopy, optical coherence tompgraphy และ multiphoton microscopy พบว่าสามารถนำส่งอนุภาคนาโนโปรวิตามินเอและวัดปริมาณเรตินัลได้ไปจนถึงชั้นหนังแท้ จากการศึกษานี้สรุปได้ว่า การใช้อนุภาคนาโนโปรวิตามินเอแบบทาเฉพาะที่ มีความปลอดภัยต่อเซลล์ทั้งระดับหลอดทดลองและไม่ก่อให้เกิดความระคายเคืองต่อผิวหนังสัตว์ทดลอง มีประสิทธิ์ศักย์และฤทธิ์ตามธรรมชาติของวิตามินเอและอนุพันธ์ในการควบคุมการเจริญของหนังกำพร้า มีความสามารถสูงในการปลดปล่อยเรตินัลให้แพร่ผ่านระหว่างเซลล์คอร์นิโอไซต์ และเข้าไปในรูขุมขนเพื่อปลดปล่อยเรตินัลที่เป็นตัวออกฤทธิ์ได้ตามระดับความลึกที่ต้องการในรูขุมขน อนุภาคนาโนโปรวิตามินเอสามารถลดผลข้างเคียงของการใช้วิตามินเอเฉพาะที่แบบเก่า และพัฒนาเป็นตัวเลือกในการรักษาโรคทางผิวหนังที่ตอบสนองต่อวิตามินเอได้ในอนาคต
Description: Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2018
Degree Name: Doctor of Philosophy
Degree Level: Doctoral Degree
Degree Discipline: Veterinary Pathobiology
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/69525
URI: http://doi.org/10.58837/CHULA.THE.2018.527
metadata.dc.identifier.DOI: 10.58837/CHULA.THE.2018.527
Type: Thesis
Appears in Collections:Vet - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5675310931.pdf4.91 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.