การประเมินความเป็นพาหะนำโรคตัวอ่อนเน่ายูโรเปียนของไรปรสิตภายนอกของผึ้งหลวง (Apis dorsata)

กนกวรรณ ตั้งสิริพัฒนาพันธุ์

Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/78886

Title:	การประเมินความเป็นพาหะนำโรคตัวอ่อนเน่ายูโรเปียนของไรปรสิตภายนอกของผึ้งหลวง (Apis dorsata)
Other Titles:	An evaluation of ectoparasitic mites as the vectors for European foulbrood (EFB) disease in giant honeybees Apis dorsata
Authors:	กนกวรรณ ตั้งสิริพัฒนาพันธุ์
Advisors:	จันทร์เพ็ญ จันทร์เจ้า ณัฐพจน์ วาฤทธิ์
Other author:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
Subjects:	ผึ้ง -- โรค ไร Bees -- Diseases Mites
Issue Date:	2563
Publisher:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract:	ผึ้งจัดเป็นแมลงสังคมที่มีความสำคัญต่อมนุษย์เป็นอย่างมาก ทั้งนี้พบว่ามีโรคในผึ้งเป็นจำนวนมาก ในโครงงานนี้เลือกศึกษาผึ้งหลวง (A. dorsata) เนื่องจากเป็นผึ้งที่แข็งแรง จึงสนใจว่าจะมีโรคมาเกี่ยวข้องมากน้อยเพียงไร แต่เปลี่ยนมาสนใจโรค American foulbrood disease (AFB) แทนโรค European FB (EFB) เนื่องจากเป็นโรคที่ร้ายแรงมาก เกิดจากแบคทีเรีย Paenibacillus larvae ที่สร้างสปอร์ได้และมีการแพร่ระบาดในผึ้งหลายชนิดทั่วโลก และเลือกศึกษาไรปรสิตภายนอกเนื่องจากมีรายงานจำนวนมากรายงานว่าสามารถเป็นพาหะนำโรคของผึ้งได้ จึงทำการเก็บตัวอย่างผึ้งหลวงจำนวน 3 รังจากจังหวัดสมุทรสงครามในเดือนกุมภาพันธ์ พ.ศ. 2564 แล้วทำการสำรวจไรปรสิตภายนอกที่เกาะผึ้งหลวงในระยะต่าง ๆ พร้อมทั้งสังเกตบริเวณที่ตัวผึ้งที่ไรปรสิตภายนอกเกาะอยู่ด้วย stereo microscope และ compound microscope, ผลพบว่าจากผึ้งหลวงตัวเต็มวัย 150 ตัว (50 ตัว/รัง) ไม่พบว่ามีไรปรสิตภายนอกเลย แต่พบไรขนาดเล็กซึ่งพบที่บริเวณปล้องอกของผึ้งตัวเต็มวัย โดยเฉพาะบริเวณขาคู่ที่ 3 จากลักษณะทางสัณฐานโดย scanning electron microscope พบว่าไรที่พบเป็น phoretic mite, ส่วนร้อยละของผึ้งตัวเต็มวัยที่มีไรเกาะ (prevalence) จากรังที่ 1, รังที่ 2 และรังที่ 3 เท่ากับ 32%, 20% และ 30% ตามลำดับ แต่ไม่พบไรใด ๆ ในผึ้งระยะไข่ ตัวอ่อน และดักแด้เลย ต่อมาจึงทำค้นหาความเป็นพาหะนำโรค AFB ของ phoretic mites ด้วยวิธี multiplex PCR, จึงนำ phoretic mites พร้อมขาผึ้งที่มีไรเกาะไปสกัด DNA ด้วย DNA extraction mini kit (cat. # 51304, QIAgen), เตรียมปฎิกิริยา PCR ในปริมาตรสุดท้าย 25 μL ที่ประกอบด้วย 12.5 μL Emerald Amp GT PCR master mix (cat. # RR310Q, Takara), 5 μL DNA (100 ng), 1 μL ของแต่ละ primer (10 μM) และ d-H₂O, มีภาวะการทางานที่เริ่มต้นด้วย 94 °C เป็นเวลา 1 min ตามด้วย 35 รอบของ 94 °C เป็นเวลา 1 min, 45 °C เป็นเวลา 1 min และ 64 °C เป็นเวลา 2 min, และสุดท้ายที่ 72 °C เป็นเวลา 7 min สังเกต PCR products ด้วย 0.8% (w/v) agarose gel electrophoresis, ทั้งนี้จาก primers 2 คู่ที่เลือกใช้, primer คู่แรก มีความจำเพาะกับ 16S rRNA ของ P. larvae คาดหวัง PCR product ขนาด 700 bp และ primer คู่ที่ 2 ที่เป็นชุดควบคุม มีความจำเพาะกับ cytochrome b ของผึ้งในสกุล Apis คาดหวัง PCR product ขนาด 500 bp, ผลพบว่าใน phoretic mites มี PCR products ของ P. larvae, จึงทำการยืนยันผลด้วยการนำ PCR products ที่ได้ส่งไปหาลำดับนิวคลีโอไทด์ ดังนั้นผลจากการศึกษานี้อาจถูกนำไปใช้ในแนวทางการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่าง phoretic mites, แบคทีเรียและผึ้ง รวมทั้งแนวทางการควบคุมโรคดังกล่าวในอนาคต
Other Abstract:	Honeybees, as eusocial insects, are important for human. However, many bee diseases have been found. In this work, due to its strength, A. dorsata was used to determine whether it was affected by diseases or not. It was focused on American foulbrood disease (AFB), instead of European FB because AFB was very severe. It was caused by Paenibacillus larvae, spore producing bacteria. Thus, it could be widely spread. Furthermore, ectoparasitic mites were investigated because, in many articles, it has been reported that they could be vectors. Three hives of A. dorsata were collected in Samut Songkram province in February, 2021. Under stereo and compound microscopes, it was found that, among 150 adults (50 bees/hive), there were no ectoparasitic mites at all. In contrast, a lot of tiny mites were found at the bee’s abdomen, especially legs of pair # 3. Considering morphology by scanning electron microscope, phoretic mites were revealed. Prevalence of adults with phoretic mites from hive # 1, 2 and 3 was 32%, 20% and 30%, respectively. No mites were observed from eggs, larvae and pupae of A. dorsata at all. Later, AFB carrying mites were investigated by multiplex PCR. DNA was extracted from phoretic mites and bee’s legs by DNA extraction mini kit (cat. # 51304, QIAgen). A reaction mixture contained 12.5 μL of Emerald Amp GT PCR master mix (cat. # RR310Q, Takara), 5 μL of DNA (100 ng), 1 μL of each primer (10 μM) and d-H₂O to make final volume of 25 μL. The condition of PCR was initiated at 94 °C for 1 min. It was followed by 35 cycles of 94 °C for 1 min, 45 °C for 1 min and 64 °C for 2 min. At last, it was at 72 °C for 7 min. PCR products were observed by 0.8% (w/v) agarose gel electrophoresis. Considering 2 pairs of primers, the first pair of primers were specific to 16S rRNA of P. larvae, with the expected size of PCR product at 700 bp while the latter pair of primers, as control, were specific to cytochrome b of Apis spp., with the expected size of PCR product at 500 bp. It showed that chosen phoretic mites might contain P. larvae. The PCR products were next sent for nucleotide sequencing. Hence, this obtained data may be used to study the interaction among phoretic mites, bacteria and honeybee leading to how to control the bee disease in the future.
Description:	โครงงานเป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต สาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ปีการศึกษา 2563
URI:	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/78886
Type:	Senior Project
Appears in Collections:	Sci - Senior Projects

Files in This Item:

File	Description	Size	Format
63-SP-BIO-002 - Kanokwon Tangsiripat.pdf		22.06 MB	Adobe PDF	View/Open

Show full item record