Abstract:
ศึกษาลักษณะโครงสร้างของไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรส (CGTase) ไอโซไซม์ จาก Bacillus circulans A11 โดยวิเคราะห์บริเวณเร่งตรวจสอบกรดอะมิโนและเพปไทด์ที่เป็นองค์ประกอบ รวมทั้งการศึกษาผลของไกลโคซิเลชันต่อแอคติวิตีและโครงสร้างของไอโซไซม์ เพื่อนำข้อมูลมาประกอบการวิเคราะห์การเกิดหลายรูปแบบของเอนไซม์ ในขั้นตอนแรกได้แยกไอโซไซม์ทั้ง 4 ของ CGTase ด้วยเทคนิคเจลอิเล็กโทรโฟริซิสแบบ preparative แล้วบ่มแต่ละไอโซไซม์ด้วยสารเคมีที่จำเพาะต่อหมู่ฟังก์ชันเพื่อดัดแปรกรดอะมิโน และใช้เทคนิคการป้องกันบริเวณเร่งด้วยสับสเตรทเมทธิล-บีด้าไซโคลเดกซ์ทรินก่อนการดัดแปร ผลการทดลองพบว่า กรดอะมิโนที่อยู่ในบริเวณเร่ง และมีความสำคัญต่อแอคติวิตีของ CGTase ไอโซไซม์ทั้ง 4 ได้แก่ ทริปโตเฟนฮิสติดีน ไทโรซีน และกรดอะมิโนในกลุ่มคาร์บอกซิลิก นอกจากนี้ไอโซไซม์ 2 และ 4 ยังมีเซรีน และไอโซไซม์ 3 ยังมีไลซีนอยู่ในบริเวณเร่งอีกด้วย ในการตรวจสอบลำดับกรดอะมิดนที่ปลาย N รวมทั้งกรดอะมิโนและเพปไทด์ที่เป็นองค์ประกอบ พบว่า ลำดับกรดอะมิโนที่ปลาย N ของทุกไอโซไซม์เหมือนกัน คือใน 5 ตำแหน่งแรกเป็น APDTS ซึ่งเหมือนกับในเอนไซม์ CGTase ก่อนแยกไอโซไซม์ ในส่วนองค์ประกอบกรดอะมิโนของทุกไอโซไซม์ก็ไม่แตกต่างกันอย่างชัดเจน และเมื่อวิเคราะห์เพปไทด์ที่เกิดจากการย่อยด้วยเอนไซม์ทริปชินด้วยคอลัมน์ C18-HPLC แบบ reverse phase ได้ผลว่า จำนวนและชนิดของเพปไทด์ (ที่แยกโดยความแตกต่างของโพลาริตี้) ของทุกไอโซไซม์ไม่มีความแตกต่างกัน เมื่อศึกษาผลของไกลโคซิเลชันต่อไอโซไซม์โดยการทำ deglycosylation ด้วยเอนไซม์ Endo H และPNGase F และด้วยสารเคมี trifluoromethanesulfonic acid สรุปได้ว่า deglycosylation ไม่มีผลต่อขนาดและประจุสุทธิของทุกไอโซไซม์ แต่มีผลต่อแอคติวิตีของไอโซไซม์ 3 และ 4 เล็กน้อย จากการวิเคราะห์โปรตีนที่เป็นส่วนประกอบในไอโซไซม์ด้วยคอลัมน์ C4-HPLC พบว่า ทุกไอโซไซม์ประกอบด้วยพีคหลัก 2 พีค ที่มีอัตราส่วนต่างกัน จากข้อมูลที่ได้ อาจสรุปได้ว่า หลายรูปแบบของ CGTase เกิดจากโปรตีนชนิดเดียวที่มีการเปลี่ยนแปลงหลังการถอดรหัสและแปรรหัสจากยีน
