Abstract:
เอ็นเอดีไคเนส (NAD kinase) เป็นเอนไซม์ที่พบทั้งในเซลล์โปรคาริโอตและยูคาริโอต มีหน้าที่สร้าง NADP+ จาก NAD+ โดยใช้พลังงานจาก ATP ผ่านปฏิกิริยาฟอสฟอริเลชัน NAD+ และ NADP+ เป็นตัวรับอิเล็กตรอนที่สาคัญในระบบเมแทบอลิซึม ควบคุมปฏิกิริยารีดอกซ์ในเซลล์ และป้องกันเซลล์จาก reactive oxygen species (ROS) ในงานวิจัยนี้เป็นการระบุหายีน NAD kinase 1 (OsNADK1) และ NAD kinase 2 (OsNADK2) จากจีโนมข้าว และโคลนเข้าสู่ pET21a(+) แล้วนาพลาสมิดรีคอมบิแนนท์ทรานฟอร์มเข้าสู่ Escherichia coli สายพันธุ์ Rosetta (DE3) pLysS และ Rosetta-gami สาหรับ OsNADK1 และ OsNADK2 ตามลาดับ จากการตรวจสอบการสร้างโปรตีนรีคอมบิแนนท์โดยวิธี SDS-PAGE และ Western blot analysis พบว่าโคลนดังกล่าวสามารถสร้างโปรตีนรีคอมบิแนนท์ของ OsNADK1 ปริมาณมากในรูปอินคลูชันบอดี ซึ่งมีขนาดประมาณ 60 kDa เมื่อนาโปรตีนมาละลายด้วยยูเรียความเข้มข้น 8 โมลาร์ ไปแยกให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์นิกเกิลแล้ว refold พบว่า โปรตีนไม่มีแอกติวีตี แต่เมื่อนาส่วน soluble protein ไปวัดแอกติวีตีด้วยวิธี in-gel activity staining พบว่า soluble protein ของทั้ง NADK1 และ NADK2 มีแอกติวีตีของ NAD kinase จึงนาส่วน soluble protein ของ NADK1 ไปแยกให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์นิกเกิลพบว่าสามารถตรวจสอบโปรตีนรีคอมบิแนนท์ด้วย SDS-PAGE และเมื่อวัดด้วยปฏิกิริยารีดิวซ์ของ DCIP ได้ค่าแอกติวิตีเท่ากับ 31.33 μmolNADP/min/mg ซึ่งสูงกว่าสารละลายโปรตีนหยาบประมาณ 23 เท่า โดยมีค่า KmNAD เท่ากับ 0.79 mM ค่า KmMgATP2- เท่ากับ 0.29 mM ค่า Vmax NAD เท่ากับ 0.35 units.mg-1protein และค่า Vmax MgATP2- เท่ากับ 2.32 units.mg-1protein จากนั้นเมื่อตรวจสอบแอกติวิตีของโปรตีนสกัดจากใบข้าวขาวดอกมะลิ 105 ที่เลี้ยงในสารละลายอาหารที่มีเกลือ 150 มิลลิโมลาร์พบว่าแอกติวิตีของ NAD kinase ลดลงตั้งแต่ 6 ชั่วโมงเป็นต้นไปและลดลงเรื่อยๆ จนถึง 24 ชั่วโมงหลังการได้รับความเค็ม เมื่อนาโปรตีนไปแยกให้บริสุทธิ์บางส่วนด้วยคอลัมน์โครมาโทกราฟีของ DEAE-Toyopearl และ Butyl-Toyopearl พบว่าแอกติวิตีของ NAD kinase (0.7 μmol NADP/min/mg) มีความบริสุทธิ์ขึ้นทั้งหมด 12 เท่า นอกจากนี้การตรวจสอบการจับกับคัลมอดุลินโดย 35S-recombinant CaM binding assay พบว่า OsCaM1-1 จับโปรตีนรีคอมบิแนนท์ NADK2 ได้อย่างจาเพาะแสดงให้เห็นว่า NADK2 น่าจะเป็นโปรตีนเป้าหมายของ OsCaM1-1
