Characterization and cDNA cloning of major royal jelly proteins of Apis cerana in Thailand

Duangporn Srisuparbh

dc.contributor.advisor	Siriporn Sittipreneed
dc.contributor.advisor	Siriwat Wongsiri
dc.contributor.advisor	Sirawut Klinbunga
dc.contributor.author	Duangporn Srisuparbh
dc.contributor.other	Chulalongkorn University. Faculty of Science
dc.date.accessioned	2012-11-16T02:50:20Z
dc.date.available	2012-11-16T02:50:20Z
dc.date.issued	2002
dc.identifier.isbn	9741728131
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/24238
dc.description	Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2002	en
dc.description.abstract	The large subunit of the ribosomal (Ir) RNA gene of Thai hive bee, Apis cerana was PCR-amplified and sequenced. Based on these nucleotide sequences, genetic differentiation analysis of A. cerana was simplified to a PCR-RFLP based on Dra I. Four haplotypes of digested IrRNA gene were observed. Haplotype A was found in north, north-east and the central region whereas haplotype B was restricted to specimens from peninsular Thailand, Phuket, and Samui Islands. Haplotype C was found in 47.06% of A. cerana originating from Samui Island but was not found in other geographic samples. Geographic heterogeneity analysis and F[subscript ST] statistics indicated the existence of population differentiation of A. cerana in Thailand (P<0.0001). Analysis of molecular variance (AMOVA) also illustrated significant genetic differences between bees from the north-to-central region (A), peninsular Thailand & Phuket (B) and Samui Island (C) (P < 0.0001). RJ of A. cerana was produced from north to central and southern samples using a queen-rearing method. Yields of RJ productions were not significant different among different be population (P>0.05). Three families of AcMRJPs were chromatographically purified by Q-Sepharose followed by Sephadex G-200 columns. All purified AcMRJPs were glycoproteins. AcMRJP1 exhibited 2 native forms; monomer (50 kDa) and oligomer (300 kDa), with the pI of 5.2-5.7. AcMRJP2 was a 55 kDa protein with the pI of 7.0-8.2 whereas AcMRJP3 natively exhibited a dimeric of 115 kDa and a denatured monomeric form of 80 kDa with the pI of 7.4-8.4. The quantitative ratio of AcMRJP1 : AcMRJP2 : AcMRJP3 in RJ was 7.2 : 2.7 : 1. Under different stored condition (-20 ℃, 4 ℃ and 37 ℃ for 1-30 days), AcMRJP3 was less stable and easier degraded than AcMRJP1 and AcMRJP2. The cDNA library was established from hypopharyngeal gland mRNA. Four family of AcMRJPs and other important metabloic-related genes (α-glucosidase, glucose oxidase and apisimin) were identified. The full length AcMRJP1 was deduced and contained a 1299 bp ORF, encoding 433 amino acid residues with 48.3% essential amino acid. In addition, the complete AcMRJP3 transcript was isolated by RT-PCR. It contained 1824 bp ORF encoding 608 amino acid residues with 39.5% essential amino acid. Semi-quantitative PCR was successfully developed and verified that the expression level of these respective protein coding genes (AcMRJP1, AcMRJP2 and AcMRJP3) was in a ratio of 3.3 : 1.6 : 1 in hypopharyngeal glands of nurse bees. Expression of these genes was not found in newly emerged bees and AcMRJP1, AcMRJP2 and AcMRJP3 transcripts of nurse bees were 1.8, 2.5 and 2.0 times greater than those of forager bees.
dc.description.abstractalternative	จากข้อมูลลำดับเบสของยีน IrRNA ของไมโทคอนเดรียที่วิเคราะห์ได้หลังเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอด้วยเทคนิค PCR พบว่าสามารถแยกความแตกต่างทางพันธุกรรมของผึ้งโพรง (Apis cerana) ได้ง่ายด้วยการตัดของเรสทริกชันเอ็นไซม์ Dra I การวิเคราะห์ตัวอย่างผึ้งโพรงในประเทศไทยพบว่ามีรูปแบบของแถบดีเอ็นเอ 4 รูปแบบหลังตัดยีน IrRNA ด้วยเรสทริกชันเอ็นไซม์ Dra I คือ รูปแบบ A และ D พบในกลุ่มตัวอย่างจากภาคเหนือ, ภาคตะวันออกเฉียงเหนือและภาคกลาง ขณะที่รูปแบบ B พบในกลุ่มตัวอย่างจากภาคใต้, เกาะภูเก็ตและเกาะสมุย และรูปแบบ C ซึ่งพบ 47.06 เปอร์เซนต์ของตัวอย่างจากเกาะสมุยโดยเป็นรูปแบบที่พบเฉพาะในกลุ่มตัวอย่างนี้เท่านั้น จากการวิเคราะห์การกระจายของรูปแบบของแถบดีเอ็นเอด้วย geographic heterogeneity และ F[subscript st] statistic พบว่ามีความแตกต่างของกลุ่มประชากรของผึ้งโพรงในประเทศไทย (P<0.0001) และจากการวิเคราะห์ด้วย AMOVA พบว่าผึ้งโพรงสามารถแบ่งออกได้เป็น 3 กลุ่มประชากรอย่างมีนัยสำคัญของตัวอย่างจากภาคเหนือถึงภาคกลาง (A), ตัวอย่างจากภาคใต้และเกาะภูเก็ต (B) และตัวอย่างจากเกาะสมุย (C) การผลิตรอยัลเยลลี่โดยวิธีการเพาะผึ้งนางพญาของผึ้งโพรงจากกลุ่มประชากรทางตอนเหนือและทางตอนใต้พบว่าไม่มีความแตกต่างกันในด้านปริมาณ (P>0.05) จากการทำโครมาโตกราฟีบนคอลัมน์ Q-Sepharose และต่อด้วยคอลัมน์ Sephadex G-200 พบว่าสามารถแยกโปรตีนหลักในรอยัลเยลลี่ได้ 3 ชนิดซึ่งเป็นไกลโคโปรตีน โดยโปรตีนหลักชนิดที่ 1 มี 2 รูปแบบคือโมโนเมอร์ที่มีน้ำหนักโมเลกุล 50 กิโลดาลตันและโอลิโกเมอร์ที่มีน้ำหนักโมเลกุล 300 กิโลดาลตัน มีค่า pI อยู่ในช่วง 5.2-5.7 นอกจากนี้ยังได้โปรตีนหลักชนิดที่ 2 มีน้ำหนักโมเลกุล 55 กิโลดาลตัน มีค่า pI อยู่ในช่วง 7.0-8.2 และโปรตีนหลักชนิดที่ 3 ซึ่งอยู่ในรูปไดเมอร์ที่มีน้ำหนักโมเลกุล 115 กิโลดาลตันในสภาวะธรรมชาติและ 80 กิโลดาลตันในสภาวะเสียสภาพ มีค่า pI อยู่ในช่วง 7.4-8.4 สัดส่วนของปริมาณโปรตีนหลักชนิดที่ 1 : ชนิดที่ 2 : ชนิดที่ 3 มีค่าเท่ากับ 7.2 : 2.7 : 1 และเมื่อนำโปรตีนหลักทั้งสามชนิดนี้บ่มที่อุณหภูมิ -20 ℃, 4 ℃ และ 37 ℃ เป็นเวลาตั้งแต่ 1 ถึง 30 วัน พบว่าโปรตีนหลักชนิดที่ 3 มีความเสถียรน้อยกว่าโปรตีนหลักชนิดที่ 1 และชนิดที่ 2 ได้สร้างห้องสมุดยีนจาก mRNA ที่ได้จากต่อมใต้คอหอย (hypopharyngeal gland) เมื่อศึกษายีนจากห้องสมุดนี้พบว่ามียีนของโปรตีนหลักในรอยัลเยลลี่ 4 ชนิดและยีนสำคัญที่เกี่ยวข้องกับแมเทบอลิซึมอื่นๆ α-glucosidase, glucose oxidase and apisimin) และพบว่าลำดับเบสของโปรตีนหลักชนิดที่ 1 ประกอบด้วย 1299 คู่เบสที่สามารถถอดรหัสให้กรดอะมิโน 433 ตัว โดยมีกรดอะมิโนจำเป็น 48.3 เปอร์เซ็นต์ การสร้างชิ้น cDNA ที่สมบูรณ์ของโปรตีนหลักชนิดที่ 3 ด้วยเทคนิค RT-PCR พบว่าลำดับเบสของโปรตีนหลักชนิดที่ 3 ประกอบด้วย 1824 คู่เบสที่สามารถถอดรหัสให้กรดอะมิโน 608 ตัวโดยมีกรดอะมิโนจำเป็น 39.5 เปอร์เซ็นต์ และจากการตรวจสอบสัดส่วนของปริมาณ mRNA ของโปรตีนหลักสามชนิด (AcMRJP1, AcMRJP2, AcMRJP3) ด้วยเทคนิค semi-quantitative PCR พบว่าการแสดงออกของโปรตีนหลักชนิดที่ 1 : ชนิดที่ 2 : ชนิดที่ 3 มีค่าเท่ากับ 33 : 1.6 : 1 โดยโปรตีนหลักทั้งสามชนิดนี้จะยังไม่มีการแสดงออกในผึ้งที่เพิ่งเกิดภายใน 24 ชั่วโมง และในผึ้งนางพยาบาลจะมีการแสดงออกของโปรตีนทั้งสามชนิดมากกว่าในผึ้งหาอาหาร โดยมีการแสดงออกของโปรตีนหลักชนิดที่ 1, 2 และ 3 มากกว่า 1.8, 2.5 และ 2.0 เท่า ตามลำดับ
dc.format.extent	4483600 bytes
dc.format.extent	8980257 bytes
dc.format.extent	13023479 bytes
dc.format.extent	19160877 bytes
dc.format.extent	4529313 bytes
dc.format.extent	786730 bytes
dc.format.extent	6572588 bytes
dc.format.mimetype	application/pdf
dc.format.mimetype	application/pdf
dc.format.mimetype	application/pdf
dc.format.mimetype	application/pdf
dc.format.mimetype	application/pdf
dc.format.mimetype	application/pdf
dc.format.mimetype	application/pdf
dc.language.iso	en	es
dc.publisher	Chulalongkorn University	en
dc.rights	Chulalongkorn University	en
dc.title	Characterization and cDNA cloning of major royal jelly proteins of Apis cerana in Thailand	en
dc.title.alternative	ลักษณะสมบัติและการโคลน cDNA ของโปรตีนหลักในนมผึ้ง ของผึ้งโพรง Apis cerana ในประเทศไทย	en
dc.type	Thesis	es
dc.degree.name	Doctor of Philosophy	es
dc.degree.level	Doctoral Degree	es
dc.degree.discipline	Biochemistry	es
dc.degree.grantor	Chulalongkorn University	en