การเพาะเลี้ยงเชื้อมาลาเรียไก่ระยะที่อยู่ในเม็ดเลือดแดง และการเก็บถนอมเชื้อแช่แข็ง

Abstract

ทดลองหาวิธีการและน้ำยาเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสม ต่อการเพาะเลี้ยงเชื้อ P.gallinaceum ระยะที่ไม่มีเพศในเม็ดเลือดแดงของไก่ในห้องทดลอง และเพื่อศึกษาวิธีการเก็บและถนอมเชื้อ P.gallinaceum ที่อุณหภูมิ -196 ํ ซ การศึกษาในครั้งนี้แบ่งเป็น 5 การทดลองคือ การทดลองที่หนึ่ง ศึกษารูปร่างลักษณะของเชื้อ P.gallinaceum ที่พบในเลือดไก่ซึ่งมี 4 ระยะ คือ trophozoite, schizont, merozoite และ gametocyte จากแผ่นฟิล์มเลือดบางย้อมสียิมซ่า การทดลองที่สอง ศึกษาระดับการติดเชื้อในกระแสเลือด อัตราการติดโรคและการก่อโรค ที่ฉีดเชื้อ P.gallinaceum โดยมีปริมาณเม็ดเลือดแดงที่ติดเชื้อจำนวน 5x10x10x10x10 เซลล์ เข้าใต้ผิวหนังลูกไก่ไข่เพศผู้อายุ 2 สัปดาห์ จำนวน 30 ตัว ผลการศึกษาพบว่า เชื้อเริ่มปรากฏในกระแสเลือดในวันที่ 4 และพบมีระดับสูงสุดในวันที่ 14 หลังจากได้รับเชื้อ ไก่มีอัตราการติดโรค ร้อยละ 100 และอัตราการตาย ร้อยละ 66.67 อาการทางคลินิกปรากฏชัดเจนในวันที่ 13 ได้แก่ ซึมขี้เขียว เลือดจาง ร้อยละ 100, 67 และ 100 ตามลำดับ ผลการผ่าซากในวันที่ 0, 4, 8, 12 และ 16 ปรากฏรอยโรคชัดเจนในวันที่ 16 ตับมีสีดำคล้ำ ม้ามขยายใหญ่และมีสีดำคล้ำ ถุงหุ้มหัวใจมีของเหลว และไตบวมน้ำ ลักษณะเด่นทางจุลพยาธิวิทยา คือ malarial pigment จำนวนมากที่ตับ และม้าม แต่พบประปรายที่ สมอง หัวใจและไต การทดลองที่สาม เพาะเลี้ยงเชื้อ P.gallinaceum ระยะไม่มีเพศที่อยู่ในเม็ดเลือดแดงของไก่ ในถาดเพาะเลี้ยงขนาด 24 หลุม ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI 1640 ที่มีส่วนผสมของ HEPES และโซเดียมไบคาร์บอเนต ในปริมาณของซีรั่มไก่ที่แตกต่างกัน และบ่ม (incubate) ในสภาวะบรรยากาศที่แตกต่างกันของ CO2:O2:N2 ที่อุณหภูมิ 37 ํซ เป็นเวลา 7 วัน ผลการศึกษาพบว่า การเพาะเลี้ยงของเชื้อ P.gallinaceum ระยะไม่มีเพศที่อยู่ในเม็ดเลือดแดงยังไม่ประสบผลสำเร็จเท่าที่ควร การทดลองที่สี่ ศึกษาการเก็บถนอมเชื้อเพื่อการแช่แข็งที่อุณหภูมิ -196 ํซ ด้วยวิธี 2-step cooling method โดยน้ำยาถนอมเชื้อ 3 ชนิด คือ glycerol-sorbitol, glycerol-lactate buffer และ polyvinyl pyrolidone เป็นระยะเวลา 1 และ 3 เดือน ผบการศึกษาพบว่า glycerol-lactate buffer มีความเหมาะสมมากกว่าอย่างอื่นในการใช้เก็บถนอมเชื้อ P.gallinaceum โดยมีอัตราการติดโรคในไก่สูงถึงร้อยละ 100 และ 60 ตามลำดับ เมื่อทดสอบโดยการฉีดเลือดเข้าไก่ การทดลองที่ห้า ศึกษาเอนไซม์ lactate dehydrogenase (LDH) ของเชื้อ P.gallinaceum ที่อยู่ในเม็ดเลือดแดงไก่ที่มีปริมาณเชื้อต่างๆ กัน โดยวัดค่า OD ที่ 650 nm ผลปรากฏว่าระดับของ เอนไซม์ LDH มีความสัมพันธ์ที่เป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณของเชื้อ โดยที่ค่าเอนไซม์จะแปรผันตามปริมาณเชื้อในเม็ดเลือดแดง