Abstract:
ยาคลาริโธรมัยซิน เป็นยาปฏิชีวนะหลักของการรักษามาตรฐานแบบ Triple therapy ที่ใช้รักษาการติดเชื้อ Helicobacter pylori ซึ่งในปัจจุบันพบว่ามีปัญหาการดื้อยาคลาริโธรมัยซินเพิ่มสูงขึ้นและทำให้การรักษาล้มเหลว กลไกการดื้อยาเกิดจากการกลายพันธุ์ในบริเวณ peptidyltransferase ของ domain V ของ ยีน 23S rRNA พบว่าการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง A2143G มีความสัมพันธ์กับการดื้อยาอย่างมีนัยสำคัญและเป็นตำแหน่งกลายพันธุ์ที่มีอุบัติการณ์สูงในหลายประเทศ งานวิจัยนี้จึงได้พัฒนาเทคนิคการตรวจวิเคราะห์เชื้อ H. pylori ที่ดื้อยาคลาริโธรมัยซิน ที่มีการกลายพันธุ์ยีน 23S rRNA ตำแหน่ง A2143G ด้วยเทคนิค Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ร่วมกับการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ (LAMP-RFLP) โดยทำการตรวจยืนยันเชื้อ H. pylori จากตัวอย่าง urease test ที่ให้ผลบวกด้วยเทคนิค PCR และตรวจการกลายพันธุ์ของ 23S rRNA ที่ตำแหน่ง A2143G ด้วยวิธี PCR –RFLP ทำการออกแบบไพรเมอร์ LAMP ของยีน 23S rRNA และ ทดสอบสภาวะที่เหมาะสม ผลพบว่าตัวอย่าง urease test ที่ให้ผลบวกจำนวน 353 ตัวอย่าง มีเชื้อ H. pylori จำนวน 101 ตัวอย่าง และมีตัวอย่างที่กลายพันธุ์ยีน 23S rRNA ตำแหน่ง A2143G คิดเป็น 7.5 เปอร์เซ็นต์ (4/53) ผลวิเคราะห์ลำดับเบสของเชื้อ H. pylori 29 สายพันธุ์ พบการกลายพันธุ์ของ 23S rRNA ตำแหน่ง A2142G, A2143G, T2182C และ A2143G+T2182C คิดเป็น 3.4, 3.4, 48.3 และ 10.3 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ สภาวะที่เหมาะสมของปฏิกิริยา LAMP ในการเพิ่มปริมาณยีน 23S rRNA ของเชื้อ H. pylori จะใช้ความเข้มข้นของสารต่างๆ ดังนี้ ไพรเมอร์ FIP/ BIP เป็น 1.6 ไมโครโมลาร์ F3/B3 เป็น 0.2 ไมโครโมลาร์ และ LF/LB เป็น 0.8 ไมโครโมลาร์ เบตาอีนเป็น 0.8 โมลาร์ ดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ไตรฟอสเฟต เป็น 1.4 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมซัลเฟต เป็น 0.6 โมลาร์ บ่มที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 60 นาที นำผลผลิต LAMP ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ BsaI พบว่าสามารถแยกระหว่าง wild type และ mutant type ได้สำเร็จ โดย wild type จะเห็นลักษณะสเมียร์แบนแบบขั้นบันได ขณะที่ A2143G mutant type จะเห็นแถบดีเอ็นเอ 3 ขนาด คือ 92, 103 และ 250 bp ดังนั้นเทคนิค LAMP-RFLP ที่พัฒนาขึ้นน่าจะเป็นวิธีที่ง่ายและรวดเร็วสำหรับตรวจการกลายพันธุ์ยีน 23S rRNA ตำแหน่ง A2143G ของเชื้อ H. pylori ซึ่งสามารถนำไปใช้ประโยชน์ในการตรวจคัดกรองการดื้อยาคลาริโธรมัยซินจากตัวอย่างเชื้อ H. pylori ที่แยกได้จากผู้ป่วยในประเทศที่มีอัตราการดื้อยาสูงเพื่อเลือกใช้ยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมได้
