การพัฒนาเทคนิค MULTIPLEX ALLELE SPECIFIC–POLYMERASE CHAIN REACTION(MAS-PCR) สำหรับตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน GYAR และ PARC ที่เกี่ยวข้องกับการดื้อยา CIPROFLOXACIN และ LEVOFLOXACIN ของเชื้อ ESCHERICHIA COLI ในโรงพยาบาลรามาธิบดี

สุกัลยาณี อ่อนสีแดง

dc.contributor.advisor	ปาหนัน รัฐวงศ์จิรกุล
dc.contributor.author	สุกัลยาณี อ่อนสีแดง
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสหเวชศาสตร์
dc.date.accessioned	2017-11-27T09:33:18Z
dc.date.available	2017-11-27T09:33:18Z
dc.date.issued	2558
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/56346
dc.description	วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2558
dc.description.abstract	เชื้อ Escherichia coli เป็นแบคทีเรีย ที่เพาะแยกได้บ่อยจากสิ่งส่งตรวจและเป็นสาเหตุหลักของการติดเชื้อทั้งในและนอกระบบทางเดินอาหาร ยากลุ่ม Quinolones เป็นยาปฏิชีวนะที่ใช้ในการรักษาการติดเชื้อที่มีสาเหตุมาจากเชื้อ E. coli โดยมีกลไกออกฤทธิ์ยับยั้งการทำงานเอนไซม์ DNA gyrase และ DNA topoisomerase IV ในกระบวนการจำลองสายดีเอ็นเอของเชื้อ ปัจจุบันสถานการณ์เชื้อ E. coli ที่ดื้อต่อยากลุ่ม Quinolones มีอัตราเพิ่มสูงขึ้นและกลายเป็นปัญหาที่สำคัญทางสาธารณะสุขทั่วโลกรวมถึงในประเทศไทย กลไกหลักที่ทำให้เชื้อดื้อต่อยากลุ่มดังกล่าวคือการกลายพันธุ์ของยีน gyrA และ parC ซึ่งอยู่ในส่วนของ Quinolone resistance determining regions (QRDRs) งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาตำแหน่งโคดอนที่กลายพันธุ์บนยีน gyrA และ ยีน parC ที่สัมพันธ์กับการดื้อยากลุ่ม Quinolones และพัฒนาเทคนิค Multiplex allele specific-Polymerase chain reaction (MAS-PCR) สำหรับใช้ตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่งโคดอน 83 และ 87 ของยีน gyrA และ 80 และ 84 ของยีน parC ซึ่งเป็นตำแหน่งหลักที่มีการกลายพันธุ์บน QRDRs เชื้อ E. coli จำนวนทั้งหมด 111 สายพันธุ์เพาะแยกได้จากสิ่งส่งตรวจในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา โรงพยาบาลรามาธิบดี กรุงเทพมหานคร ประเทศไทย เชื้อทั้งหมดถูกทดสอบความไวต่อยา Ciprofloxacin และยา Levofloxacin ด้วยวิธี E-test® และให้ผลไวต่อยาจำนวน 16 และ 19 สายพันธุ์ ดื้อปานกลางต่อยาจำนวน 3 และ 16 สายพันธุ์ และดื้อต่อยาจำนวน 92 และ 76 สายพันธุ์ตามลำดับ ผลวิเคราะห์ลำดับเบสด้วยเทคนิค Sequencing พบการกลายพันธุ์ในเชื้อจำนวน 99 สายพันธุ์ (89.19 เปอร์เซ็นต์) ทั้งหมด 8 รูปแบบ ได้แก่ Ser83-Lue, Asp87-Asn, Asp87-Tyr, Ser80-Ile, Glu84-Gly, Glu84-Val, Ala90-Val และ Ala108-Thr โดยเชื้อส่วนใหญ่ 92 สายพันธุ์ (82.88 เปอร์เซ็นต์) มีการกลายพันธุ์ร่วมกันอย่างน้อย 3 ตำแหน่ง ได้แก่ Ser83-Leu+Asp87-A-sn+Ser80-Ile และ Ser83-Leu+Asp87-Tyr+Ser80-Ile เทคนิค MAS-PCR มีความไวและความจำเพาะเมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิค Sequencing ซึ่งเป็นวิธีมาตรฐานในการตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่งโคดอน 83 และ 87 ของยีน gyrA และ 80 และ 84 ของยีน parC เท่ากับ 96.97, 100, 100, 93.33 และ 100, 100, 100 และ 98.48 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ เทคนิค MAS-PCR เป็นเทคนิคที่สะดวก ไม่ซับซ้อน สามารถที่จะนำมาใช้ตรวจวินิจฉัยการกลายพันธุ์ที่สัมพันธ์กับการดื้อต่อยา Quinolone ในเชื้อ E. coli ได้อย่างมีประสิทธิภาพทั้งในห้องปฏิบัติการและในการศึกษาระบาดของเชื้อดื้อยา
dc.description.abstractalternative	Escherichia coli is bacteria that often isolated from clinical specimens and is a causative agent of intra- and extraintestinal infections. Quinolones is one of drug of choice for treatment of E. coli infections. The agents inhibit bacterial DNA replication after binding to drug’s targets, including DNA gyrase and DNA topoisomerase IV. Quinolone-resistant E. coli infection becomes a global problem, including in Thailand. The quinolones resistance usually occurs mainly due to specific point of mutations of gyrA and parC genes within the quinolone resistance-determining regions (QRDRs). Here we appraised type of the gyrA and parC mutations associated in quinolone resistance and also developed Multiplex allele specific-Polymerase chain reaction (MAS-PCR) for detection of “hot spot” mutations at gyrA codon of 83 and 87, and parC codon of 80 and 84 in the QRDRs. One hundred and eleven E. coli were isolated from Microbiology unit, Ramathibodi Hospital, Bangkok, Thailand, and were tested for antimicrobial susceptibility by E-test®. Sixteen and 19 strains were susceptible, 3 and 16 were intermediate and 92 and 76 were resistant to Ciprofloxacin and Levofloxacin, respectively. Ninety-nine (89.19%) E. coli isolates had mutations in the QRDRs as revealed by sequencing analysis. Eight amino acid substitutes were reported, including Ser83-Lue, Asp87-Asn, Asp87-Tyr, Ser80-Ile, Glu84-Gly, Glu84-Val, Ala90-Val and Ala108-Thr. Most of the isolates, 92 (82.88%), had at least three point mutations that were Ser83-Leu+Asp87-Asn+Ser80-Ile and Ser83-Leu+Asp87-Tyr+Ser80-Ile. MAS-PCR detected codons 83 and 87 in gyrA and codons 80 and 84 in parC mutations, yielding 96.97, 100, 100, and 93.33% sensitivity, respectively, and 100, 100, 100, and 98.48% specificity, respectively, for quinolones resistance relative to a gold standard sequencing. MAS-PCR is simple and convenient, and may be used for simultaneously rapid detection of gyrA and parC mutations associated in quinolone resistance in routine laboratory as well as in epidemiology study
dc.language.iso	th
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.relation.uri	http://doi.org/10.14457/CU.the.2015.445
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.subject	เอสเคอริเคียโคไล
dc.subject	ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส
dc.subject	Escherichia coli
dc.subject	Polymerase chain reaction
dc.subject	Quinolone antibacterial agents
dc.title	การพัฒนาเทคนิค MULTIPLEX ALLELE SPECIFIC–POLYMERASE CHAIN REACTION(MAS-PCR) สำหรับตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน GYAR และ PARC ที่เกี่ยวข้องกับการดื้อยา CIPROFLOXACIN และ LEVOFLOXACIN ของเชื้อ ESCHERICHIA COLI ในโรงพยาบาลรามาธิบดี
dc.title.alternative	DEVELOPMENT OF MULTIPLEX ALLELE SPECIFIC–POLYMERASE CHAIN REACTION(MAS-PCR) FOR DETECTION OF GYRA AND PARC GENES MUTATION ASSOCIATED WITH CIPROFLOXACIN AND LEVOFLOXACIN RESISTANCE OF ESCHERICHIA COLI IN RAMATHIBODI HOSPITAL
dc.type	Thesis
dc.degree.name	วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
dc.degree.level	ปริญญาโท
dc.degree.discipline	วิทยาศาสตร์ระดับโมเลกุลทางจุลชีววิทยาทางการแพทย์และวิทยาภูมิคุ้มกัน
dc.degree.grantor	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.email.advisor	Panan.P@Chula.ac.th,Panan_etc@yahoo.com,panan_etc@yahoo.com
dc.identifier.DOI	10.14457/CU.the.2015.445