การคัดกรองและลักษณะสมบัติของไลเพสจากแบคทีเรียชอบเค็มปานกลาง

Abstract

ในการคัดแยกแบคทีเรียชอบเค็มปานกลางจำนวนทั้งหมด 77 สายพันธุ์ จากตัวอย่างกะปิทั้งหมด 8 ตัวอย่าง ที่เก็บจากตลาดสดมหาชัย จังหวัดสมุทรสาคร จากการคัดกรองสร้างเอนไซม์ไลเพสบนอาหารแข็งที่มีสับเสตรทเป็น Tween 20, 40, 60, 80 และ tributyrin พบว่ามีแบคทีเรียจำนวน 61 สายพันธุ์สามารถผลิตเอนไซม์ไลเพสได้ และมีแบคทีเรียจำนวน 23 สายพันธุ์ สามารถผลิตเอนไซม์ไลเพสได้เมื่อนำมาคัดกรองการผลิตเอนไซม์ไลเพสในอาหารเหลวที่มีสับเสตรทเป็น p-Nitrophenyl butyrate (p-NPB) จึงได้คัดเลือกตัวแทนแบคทีเรียชอบเค็มปานกลางที่มีแอกทิวิตีการผลิตเอนไซม์ไลเพสจำนวน 12 ไอโซเลท และไอโซเลทที่ไม่มีแอกทิวิตีจำนวน 26 ไอโซเลท ในอาหารเหลวมาศึกษาลักษณะทางฟีโนไทป์และวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 16S rRNA พบว่าสามารถจัดกลุ่มแบคทีเรียตัวแทนที่ย้อมติดสีแกรมบวกทั้งหมด 38 ไอโซเลทได้เป็นทั้งหมด 9 สกุล ได้แก่ สกุล Oceanobaillus (2 สายพันธุ์), Virgibacillus (2 สายพันธุ์), Halobacillus (2 สายพันธุ์), Thalassobacillus (2 สายพันธุ์), Bacillus (5 สายพันธุ์), Staphylococcus (9 สายพันธุ์), Salinicoccus (12 สายพันธุ์), Nesterenkonia (2 สายพันธุ์) และ Allobacillus (2 สายพันธุ์) จากการศึกษาลักษณะอนุกรมวิธานแบบโพลีฟาสิกของ Allobacillus sp. 2 สายพันธุ์ ได้แก่ SKP4-8 และ SKP8-2 จัดเป็นแบคทีเรียสปีชีส์ใหม่ ซึ่งมีผลการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณยีน 16S rRNA ของสายพันธุ์ SKP4-8 และ SKP8-2 ใกล้เคียงกับสายพันธุ์ Allobacillus halotolerans B3AT เป็น 99.14 และ 98.80 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ และทั้ง 2 สายพันธุ์ มีความคล้ายคลึงของ DNA เป็น 46.6 ถึง 56.8 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับ Allobacillus halotolerans B3AT ตามลำดับ จึงสามารถเสนอทั้ง 2 สายพันธุ์เป็นแบคทีเรียชอบเค็มปานกลางสปีชีส์ใหม่ชื่อว่า Allobacillus saliphilus

จากการศึกษาการผลิตเอนไซม์ไลเพสของสายพันธุ์ SKP5-4 ซึ่งพิสูจน์เอกลักษณ์ได้เป็น Virgibacillus halodenitrificans และพบว่าสามารถสร้างเอนไซม์ไลเพสได้สูงสุดในระยะ stationary phase เมื่อเลี้ยงในอาหารดัดแปลงสูตร JCM no. 377 ที่ความเข้มข้นเกลือ 5 เปอร์เซ็นต์ พีเอช 8.0 อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 ชั่วโมง แล้วทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิค acetone precipitation, anion exchange chromatography พบว่าไลเพสที่ได้มีความบริสุทธิ์ขึ้นถึง 11.6 เท่า มีขนาดมวลโมเลกุล 50, 43, 30 และ 12 กิโลดาลตันและลักษณะสมบัติของเอนไซม์ไลเพสสามารถทำงานได้ดีที่สุดในสภาวะที่พีเอช 7.0 ความเข้มข้นเกลือโซเดียมคลอไรด์ 2 เปอร์เซ็นต์ และอุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส นอกจากนี้เอนไซม์ยังมีความจำเพาะเจาะจงต่อสับสเตรท p-nitrophenyl butyrate (C4:0)