การใช้ RFLPs ของชิ้นส่วนบริเวณ nodD1 และ nodA ของไรโซเบียมถั่วเหลือง ระบุศักยภาพการตรึงไนโตรเจน

Abstract

ถั่วเหลืองเป็นพืชเศรษฐกิจที่ใช้เป็นอาหารและแปรเป็นผลิตภัณฑ์อื่น เช่น น้ำมันถั่วเหลือง น้ำนมถั่วเหลือง เต้าหู้ เต้าเจี้ยว และซีอิ๊ว นอกจากนี้ เกษตรกรบางรายปลูกถั่วเหลืองเป็นพืชหมุนเวียน เพราะที่ปมรากถั่วเหลืองมีแบคทีเรียไรโซเบียม ช่วยเปลี่ยนไนโตรเจนจากอากาศให้เป็นแอมโมเนียให้ถั่วเหลืองใช้ในการเจริญเป็นการลดการใช้ปุ๋ยเคมีเช่น ยูเรีย เกษตรกรในประเทศที่เป็นผู้นำด้านการส่งออกถั่วเหลือง เช่นสหรัฐอเมริกา จึงปลูกถั่วเหลืองเป็นพืชหมุนเวียน สลับกับพืชเศรษฐกิจชนิดอื่น เช่น ข้าวโพด เป็นการบำรุงดินอย่างยั่งยืน ปัจจุบันพื้นที่เพาะปลูกถั่วเหลืองในประเทศไทยลดลงเหลือประมาณ 831,000 ไร่ (1 ไร่ เท่ากับ 1,600 ตารางเมตร) เพราะราคาขายเฉลี่ยของถั่วเหลืองต่ำ (12 บาทต่อกิโลกรัม) ทำให้ไม่คุ้มทุนแก่เกษตรกรในการปลูกถั่วเหลืองเป็นพืชหมุนเวียน เกษตรกรไทยจึงใช้ปุ๋ยเคมีในการปลูกพืชชนิดอื่นที่ทำรายได้ให้เกษตรกรสูงกว่าถั่วเหลือง เช่น ข้าว ข้าวโพด อ้อย ยางพารา ปาล์ม และมันสำปะหลัง ซึ่งการใช้ปุ๋ยเคมีปริมาณมากและใช้ติดต่อกันเป็นเวลานาน ทำให้ดินขาดความอุดมสมบูรณ์ เนื่องจากการใช้ปุ๋ยเคมีไม่ใช่การบำรุงดินแต่เป็นการอัดธาตุอาหารให้พืช โดยไม่มีการเติมอินทรียวัตถุเพิ่มลงในดิน และการใช้ปุ๋ยเคมียังเร่งอัตราการสลายตัวของอินทรียวัตถุในดิน ให้โครงสร้างของดินเสื่อมลง ดินจึงอัดตัวแน่น ไม่อุ้มน้ำในฤดูแล้ง วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เพื่อหาความสัมพันธ์ระหว่างศักยภาพการตรึงไนโตรเจนของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 58 สายพันธุ์กับ RFLP5 ซึ่งในงานวิจัยนี้หมายถึงรูปแบบการเรียงตัวบนอกาโรสเจลของแถบดีเอ็นเอของชิ้นส่วนระหว่างยีน nodD1 และยืน nodA หลังจากตัดด้วยเรสตริกชั่นเอนไซม์ sphl ซึ่งถ้าตรวจพบความสัมพันธ์ดังกล่าว จะสามารถใช้รูปแบบการเรียงตัวหรือ RFLPs ดังกล่าวในการทำนายศักยภาพการตรึงไนโตรเจนของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า ผลการทดสอบความสามารถของแบคทีเรียประเภทเพิ่มจำนวนเร็วที่แยกจากอำเภอชาติตระการ อำเภอพรหมพิราม และอำเภอบางระกำ จังหวัดพิษณุโลก จำนวน 8 สายพันธุ์ที่แยกได้พร้อมกับการแยกไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า และเติมลงในโหลเลียวนาร์ดที่เลี้ยงถั่วเหลืองแต่ละพันธุ์จำนวน 7 พันธุ์ พบว่าแบคทีเรียทั้ง 8 สายพันธุ์ไม่สร้างปมที่รากถั่วเหลือง แบคทีเรียประเภทเพิ่มจำนวนเร็วทั้ง 8 สายพันธุ์จึงไม่ใช่ไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนเร็ว ผลการหา RFLP ของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 58 สายพันธุ์ พบว่าไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 45 สายพันธุ์ มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอบริเวณระหว่างยืน nodD1 และยืน nodA ซึ่งแยกโดยวิธี พีซีอาร์โดยใช้ nodYf (5’TGTACGCGGGTAAACC3’) และ nodYr (5’AGCGCAACGAGAAGAT3’) เป็นไพรเมอร์ขนาด 395 คู่เบส และไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 13 สายพันธุ์ มีชิ้นส่วนดีเอ็นเอดังกล่าวขนาด 350 คู่เบส ทั้งนี้เมื่อแยกชิ้นส่วนดีเอ็นเอออกจากอกาโรสเจลและทำให้ดีเอ็นเอปราศจากสิ่งปนเปื้อนโดยใช้ชุดสำเร็จรูป Nucleospin และตัดชิ้นส่วนดีเอ็นเอด้วยเรสตริกชั้นเอนไซม์ sphl ผลการทดลองพบรูปแบบ RFLPs จำนวน 3 รูปแบบ ได้แก่ รูปแบบ A ประกอบด้วยชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาด 395 คู่เบส รูปแบบ B ประกอบด้วยชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาด 350 คู่เบส และรูปแบบ C ประกอบด้วยชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาด 120 และ 275 คู่เบส โดยไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 30, 12, และ 16 สายพันธุ์มี RFLPs รูปแบบ A, B และ C ตามลำดับ ทั้งนี้พบว่าไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าที่มี RFLPS รูปแบบ A, B และ C มีแนวโน้มที่มีจำนวนปมทั้งหมดที่รากในระดับน้อย (1-10 ปมต่อต้น) ถึงระดับปานกลาง (11-20 ปมต่อต้น) ผลการทดลองไม่พบความสัมพันธ์ระหว่างรูปแบบ RFLPs กับศักยภาพการตรึงไนโตรเจนของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า ซึ่งหาโดยการใช้น้ำหนักแห้งของลำต้น ในปัจจุบันยังไม่ทราบหน้าที่ของดีเอ็นเอซึ่งอยู่ระหว่าง nodD1 และ nodA ซึ่งได้แก่ nodY ในไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า ดังนั้นผลการทดลองที่ไม่พบความสัมพันธ์ระหว่างรูปแบบ RFLPs ของ nodY กับศักยภาพการเข้าสร้างปมและศักยภาพการตรึงไนโตรเจนของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า อาจชี้ให้เห็นว่า nodY อาจไม่มีบทบาทสำคัญในกระบวนการเข้าสร้างปมและกระบวนการตรึงไนโตรเจนของไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้า