การโคลนและการแสดงออกของยีนที่กำหนดรหัส Glutathione S-transferase จากเอ็กซ์ทรีโมไฟล์ Halothece sp. PCC7418

ยศกร สมัญ

dc.contributor.advisor	รุ่งอรุณ วาดิถี สิริศรัทธา
dc.contributor.author	ยศกร สมัญ
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
dc.date.accessioned	2020-03-20T06:51:38Z
dc.date.available	2020-03-20T06:51:38Z
dc.date.issued	2561
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/64374
dc.description	โครงงานเป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต ภาควิชาจุลชีววิทยา. คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ปีการศึกษา 2561	en_US
dc.description.abstract	ไซยาโนแบคทีเรีย เป็นแบคทีเรียที่สามารถสังเคราะห์ด้วยแสงภายใต้ภาวะที่มีออกซิเจน จึง จัดเป็นผู้ผลิตที่สำคัญในระบบนิเวศ อีกทั้งสามารถพบไซยาโนแบคทีเรียได้เกือบทุกพื้นที่ไม่ว่าจะเป็น บนบก น้ำ ทะเล น้ำจืด ยิ่งไปกว่านั้น ยังพบได้ในภาวะแวดล้อมที่ไม่เหมาะสมต่อการดำรงชีวิต เช่น ภาวะที่ความเข้มข้น ของเกลือสูง จะทำให้เซลล์ของสิ่งมีชีวิตเกิดความเครียดจนสามารถตายได้ แต่อย่างไรก็ตามไซยาโนแบคทีเรียก็ สามารถอยู่รอดได้ด้วยกลไกการตอบสนองต่อความเครียดซึ่งมีหลายชนิด ไม่ว่าจะเป็น เอนไซม์ สารเมแทบอ ไลท์ทุติยภูมิ โดยงานวิจัยนี้ศึกษาเอนไซม์ Glutathione S-transferase (GST) ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่มีบทบาทหลัก ในการลดความเป็นพิษภายในเซลล์ รวมไปถึงการตอบสนองต่อภาวะความเครียด จากการสืบค้นข้อมูลทางชี วสารสนเทศพบว่า ภายในจีโนมของ Halothece sp. PCC7418 มียีนกำหนดรหัส GST ทั้งหมด 4 ยีน ได้แก่ PCC7418_1478, PCC7418_0729, PCC7418_3557 และ PCC7418_0647 โดยในการศึกษาครั้งนี้ได้เลือก มาศึกษา 2 ยีน คือ PCC7418_1478 และ PCC7418_0729 ซึ่งยีน PCC7418_1478 จะกำหนดรหัส GST ที่มี ลำดับกรดอะมิโน 186 เรซิดิว มวลโมเลกุลทางทฤษฎีประมาณ 21 กิโลดาลตัน ค่า pI ทางทฤษฎี 5.44 ส่วนยีน PCC7418_0729 กำหนดรหัส GST ที่มีลำดับกรดอะมิโน 399 เรซิดิว มวลโมเลกุลทางทฤษฎีประมาณ 46 กิโล ดาลตัน ค่า pI ทางทฤษฎี 5.48 ซึ่งได้นำยีนกำหนดรหัส GST ทั้ง 2 ยีนโคลนเข้าเวกเตอร์แสดงออก pColdI ซึ่ง ผลจากการสร้างพลาสมิดลูกผสมของยีน PCC7418_1478 พบว่ามีทรานสฟอร์แมนท์ที่สามารถรับพลาสมิ ดลูกผสมที่มียีน PCC7418_1478 แทรกสอดได้ แล้วนำมายืนยันด้วยการนำพลาสมิดลูกผสมมาตัดด้วยเอนไซม์ ตัดจำเพาะ NdeI และ BamHI ซึ่งได้แถบดีเอ็นเอขนาดใกล้เคียงกับ PCC7418_1478 และ pColdI จึงได้นำไป วิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนต่อไป แต่การสร้างพลาสมิดลูกผสมของยีน PCC7418_0729 กลับไม่ สามารถตรวจพบทรานสฟอร์แมนท์ที่สามารถรับพลาสมิดลูกผสมที่มียีน PCC7418_0729 ได้ และจากการ ตรวจสอบการแสดงออกของโปรตีนจากยีน PCC7418_1478 ด้วยวิธี SDS-PAGE ไม่พบแถบของโปรตีนที่มี ขนาดประมาณ 21 กิโลดาลตัน อีกทั้งจากการตรวจสอบด้วยวิธี เวสเทิร์น บลอททิง ก็ไม่พบสัญญาณการ แสดงออกของโปรตีนด้วยเช่นกัน ซึ่งอาจเป็นผลมาจากความเข้มข้นของสารเหนี่ยวนำไม่เหมาะสม หรือ เวลาที่ ใช้ในการเหนี่ยวนำไม่เหมาะสมที่จะทำให้เกิดการแสดงออกได้ ดังนั้นจึงควรหาภาวะที่เหมาะสมต่อการ แสดงออกของยีนเพื่อให้ยีนได้เกิดการแสดงออก ซึ่งสามารถใช้ในการศึกษาต่อไป	en_US
dc.description.abstractalternative	Cyanobacteria are oxygenic photosynthetic bacteria which are considered to be important producer in ecosystem. Also, cyanobacteria can be found in a wide variety of habitats ranging from terrestrials to marine habitats. Interestingly, cyanobacteria can also be found in extreme environments, such as hypersaline environments that stressed cell of living organisms until lethal. However, cyanobacteria can survive in extreme environments with stress response mechanisms including enzyme and secondary metabolite. This study aims to study Glutathione S-transferase. The enzyme has predominant role of cellular detoxification. Moreover, it also can play a role in stress response. From bioinformatics analysis revealed that the whole genome of Halothece sp. PCC7418 encodes four putative GST genes which are PCC7418_1478, PCC7418_0729, PCC7418_3557 and PCC7418_0647. In this study focused on two genes that are PCC7418_1478 and PCC7418_0729. PCC7418_1478 comprises of 186 amino acid residues, theoretical molecular weight is 21 kDa and theoretical pI is 5.44. For another, it comprises of 399 amino acid residues, theoretical molecular weight is 46 kDa and theoretical pI is 5.48. These two genes were cloned into expression vector, pColdI. Construction of PCC7418_1478 into pColdI was success in which was confirmed by colony PCR and restriction analysis, respectively. In case of PCC7418_0729, construction was not success. The following step was recombinant protein expression analysis of PCC7418_1478 using SDS-PAGE. The results revealed no target protein (corresponding to 21 kDa) was induced. Western blotting analysis was not obtained specific band. These negative results may cause by concentration of inducer or time of induction (not suitable for protein expression). So, the optimization of protein expression will be required for further study.	en_US
dc.language.iso	th	en_US
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.title	การโคลนและการแสดงออกของยีนที่กำหนดรหัส Glutathione S-transferase จากเอ็กซ์ทรีโมไฟล์ Halothece sp. PCC7418	en_US
dc.title.alternative	Molecular cloning and expression of glutathione S-transferase encoding gene from extremophile Halothece sp. PCC7418	en_US
dc.type	Senior Project	en_US
dc.email.advisor	Rungaroon.W@chula.ac.th