การสังเคราะห์พีเอ็นเอแอเรย์บนกระดาษกรองดัดแปรพื้นผิว เพื่อใช้ตรวจสอบลำดับเบสของสารพันธุกรรม

เกรียงศักดิ์ ฝ้ายเครือ; กชกร ศุภบวรสถิตย์

dc.contributor.advisor	ธีรยุทธ วิไลวัลย์
dc.contributor.author	เกรียงศักดิ์ ฝ้ายเครือ
dc.contributor.author	กชกร ศุภบวรสถิตย์
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
dc.date.accessioned	2020-06-17T05:14:13Z
dc.date.available	2020-06-17T05:14:13Z
dc.date.issued	2557
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/66431
dc.description	โครงงานเป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ปีการศึกษา 2557	en_US
dc.description.abstract	กระดาษกรองเป็นวัสดุที่เหมาะแก่การนำมาใช้เป็นวัฏภาคของแข็งสำหรับการตรึงสารชีวโมเลกุลเพื่อใช้ เป็นตัวตรวจวัดเชิงชีวภาพ เนื่องจากกระดาษกรองเป็นวัสดุที่หาได้ง่าย, สามารถเข้ากันได้กับระบบชีวภาพ และ สามารถดัดแปรพื้นผิวเป็นหมู่ฟังก์ชันต่างๆ ได้หลากหลาย ในงานวิจัยนี้ นำพิโรลิดินิลพีเอ็นเอ ซึ่งมีโครงสร้างหลัก เป็น D-prolyl-2-aminocyclopentanecarboxylic acid (เอซีพีซีพีเอ็นเอ, ในงานนี้จะเรียกเป็นพีเอ็นเอ) ตรึง บนพื้นผิวเซลลูโลสเพื่อใช้เป็นโพรบในการตรวจสอบลำดับเบสของดีเอ็นเอ ขั้นแรกเป็นสังเคราะห์ไดแอลดีไฮด์ เซลลูโลส หรือ ดีเอซี โดยการดัดแปรพื้นผิวกระดาษกรองโดยปฏิกิริยาออกซิเดชันบางส่วนด้วยโซเดียมเปอร์ ไอโอเดตผสมลิเทียมคลอไรด์ และพิสูจน์เอกลักษณ์หมู่แอลดีไฮด์ที่เกิดขึ้นโดยใช้การทดสอบที่ทำให้เกิดสีโดย 2,4-dinitrophenylhydrazine จากนั้นเป็นการตรึงพีเอ็นเอโพรบลงบนกระดาษกรองที่ผ่านดัดแปรพื้นผิวด้วย ปฏิกิริยารีดักทีฟแอลคิลเลชันโดยมีโซเดียมไซยาโนโบโรไฮไดรด์อยู่ด้วย การทดสอบโดยใช้พีเอ็นเอติดฉลาก ฟลูออเรสซีนยืนยันว่าสามารถตรึงพีเอ็นเอบนกระดาษกรองดัดแปรพื้นผิวได้จริง ลำดับถัดมาเป็นการตรวจสอบ ความสามารถในการจับยึดระหว่างพีเอ็นเอที่ถูกตรึงกับดีเอ็นเอที่เป็นคู่สมกันโดยใช้พีเอ็นเอไม่ติดฉลากกับ ดีเอ็นเอติดฉลากฟลูออเรสซีน พบว่าสามารถตรวจวัดสัญญาณฟลูออเรสเซนส์ภายใต้แสงยูวีได้ที่ปริมาณดีเอ็นเอ ตัวอย่างเพียง 0.35 pmol แสดงให้เห็นถึงศักยภาพของวิธีการตรึงพีเอ็นเอบนกระดาษดัดแปรพื้นผิวเป็นหมู่ แอลดีไฮด์นี้ในการสร้างเป็นพีเอ็นเอแอเรย์ นอกจากนี้ ในงานวิจัยยังได้พัฒนาวิธีการตรวจสอบความสามารถใน การจับยึดระหว่างพีเอ็นเอที่ถูกตรึงกับดีเอ็นเอที่เป็นคู่สมกันโดยอาศัยปฏิกิริยาสร้างสีที่สามารถมองเห็นได้ด้วย ตาเปล่าโดยอาศัยเอนไซม์ เพื่อเพิ่มความไวในการตรวจวัดและเลี่ยงการใช้วิธีติดฉลากฟลูออเรสซีนที่มีราคาแพง บนสายดีเอ็นเอเป้าหมาย โดยเมื่อเกิดการจับยึดระหว่างพีเอ็นเอโพรบกับดีเอ็นเอติดฉลากไบโอติน แล้วเติม เอนไซม์ horseradish peroxidase ที่เชื่อมต่อกับสเตรปตาวิดิน ตามด้วย o-phenylenediamine/H2O2 จะได้ ผลิตภัณฑ์สีเหลืองซึ่งสามารถสังเกตเห็นได้ด้วยตาเปล่า โดยดีเอ็นเอเซ็นเซอร์ที่ประกอบด้วยพีเอ็นเอโพรบที่ตรึง บนกระดาษกรองดัดแปรพื้นผิวเมื่อใช้ร่วมกับวิธีการตรวจวัดด้วยปฏิกิริยาสร้างสีที่สามารถมองเห็นได้ด้วย ตาเปล่าโดยอาศัยเอนไซม์มีขีดจำกัดต่ำพอที่จะตรวจวัดดีเอ็นเอที่มีปริมาณต่ำกว่าระดับ picomole ได้ ทั้งยังมี ความจำเพาะเจาะจงที่ดีโดยสามารถแยกความแตกต่างของดีเอ็นเอที่ติดฉลากไบโอติน 2 สายที่มีลำดับเบส ต่างกันเพียง 1 ตำแหน่งได้อย่างชัดเจน	en_US
dc.description.abstractalternative	Cellulose-based filter paper is an attractive material for immobilization of biomolecular probes for sensing applications due to its general availability, biocompatibility, and possibilities for a wide range of surface functionalizations. In this work, pyrrolidinyl peptide nucleic acid with a rigid D-prolyl-2-aminocyclopentanecarboxylic acid backbone (acpcPNA, will be simply referred to as PNA) is immobilized on to a cellulose surface to be used as a probe for DNA sequence determination. First, a dialdehyde-modified cellulose (DAC) was prepared by partial oxidation of cellulose paper with sodium periodate in the presence of lithium chloride. The presence of the aldehyde group was revealed by a color test with 2,4-dinitrophenylhydrazine. The PNA probe was next immobilized by reductive alkylation in the presence of sodium cyanoborohydride. By employing a fluorescein-labeled acpcPNA probe, successful immobilization of the PNA was demonstrated. Next, the ability of the immobilized PNA probe to capture the DNA target from the sample was confirmed using unlabeled PNA probe and fluorescein-labeled DNA. As low as 0.35 pmol of fluorescein-labeled DNA could be detected under UV light, suggesting the potential of this aldehyde-based immobilization strategy in fabrication of PNA arrays. Furthermore, an enzyme-based colorimetric detection was also developed in order to improve the sensitivity and avoid the expensive fluorescence labeling of the DNA target. Upon hybridization between the immobilized PNA probe and biotinylated DNA target followed by treatment with streptavidin-horseradish peroxidase conjugate, a colorimetric reaction was achieved by treatment with o-phenylenediamine/H2O2 which allowed visual detection of the yellow product formed. The cellulose-based DNA sensor with immobilized PNA probe and enzyme-based colorimetric detection is sensitive enough to detect sub-picomole amounts of synthetic DNA targets with sufficient specificity to discriminate between complementary and single base mismatch DNA targets.	en_US
dc.language.iso	th	en_US
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.title	การสังเคราะห์พีเอ็นเอแอเรย์บนกระดาษกรองดัดแปรพื้นผิว เพื่อใช้ตรวจสอบลำดับเบสของสารพันธุกรรม	en_US
dc.title.alternative	Synthesis of PNA arrays on modified filter papers for DNA sequence determination	en_US
dc.type	Senior Project	en_US
dc.email.advisor	Tirayut.V@Chula.ac.th