การพัฒนาเทคนิค RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION เพื่อตรวจหาเชื้อ Mycobacterium avium COMPLEX ด้วยตาเปล่า

เทิดศักดิ์ สุธาตุ

dc.contributor.advisor	ปาหนัน รัฐวงศ์จิรกุล
dc.contributor.author	เทิดศักดิ์ สุธาตุ
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสหเวชศาสตร์
dc.date.accessioned	2020-11-11T09:51:11Z
dc.date.available	2020-11-11T09:51:11Z
dc.date.issued	2562
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/69384
dc.description	วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2562
dc.description.abstract	โรคติดเชื้อที่มีสาเหตุมาจาก Mycobacterium avium complex (MAC) มีอุบัติการณ์เพิ่มสูงขึ้นทั่วโลกรวมทั้งในประเทศไทย เนื่องมาจากการเพิ่มขึ้นของจำนวนผู้ป่วยที่มีภาวะภูมิคุ้มกันของร่ายกายต่ำ การวินิจฉัยเชื้อ MAC ในปัจจุบันที่อาศัยการเพาะเลี้ยงเชื้อและทดสอบปฏิกิริยาชีวเคมี นอกจากใช้ระยะเวลานานแล้ว ยังไม่สามารถจำแนกเชื้อได้ถึงระดับสปีชี่ส์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเชื้อ Mycobacterium avium และเชื้อ Mycobacterium intracellulare ซึ่งเป็นเชื้อ MAC ที่สำคัญและเพาะแยกได้บ่อยจากสิ่งส่งตรวจ ดังนั้นวัตถุประสงค์ของการศึกษาในครั้งนี้ คือการพัฒนาเทคนิค Recombinase Polymerase Amplification ร่วมกับการอ่านผลด้วยสี SYBR Green I (RPA/SYBR) ในการตรวจวินิจฉัยเชื้อ MAC ซึ่งอาศัยการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมภายใต้อุณหภูมิคงที่ ร่วมกับไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อเชื้อกลุ่ม MAC เชื้อ M. avium และเชื้อ M. intracellulare และอ่านผลที่เกิดขึ้นด้วยตาเปล่าได้ในทันทีภายหลังการเติมสี SYBR Green I ผลจากการทดสอบกับตัวอย่าง DNA ของเชื้อ MAC จำนวน 120 ตัวอย่าง พบว่าเทคนิค RPA/SYBR สามารถตรวจวินิจฉัยจำแนกสปีชี่ส์ของเชื้อ M. avium และเชื้อ M. intracellulare ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยมีความไว 100% และความจำเพาะตั้งแต่ 80.7% ขึ้นไป ซึ่งจัดว่ามีความสอดคล้องในเกณฑ์ดีมากเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีหาลำดับเบส (สถิติ Kappa มีค่าตั้งแต่ 0.801 ขึ้นไป) ในขณะที่เมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิค PCR มีความไวตั้งแต่ 89.2% ขึ้นไปและความจำเพาะตั้งแต่ 97.5% ขึ้นไป และมีความสอดคล้องในเกณฑ์ดีมากเช่นเดียวกัน (สถิติ Kappa มีค่าตั้งแต่ 0.863 ขึ้นไป) นอกจากนี้เทคนิค RPA/SYBR ยังมีค่าความเข้มข้นของ DNA ต้นแบบน้อยที่สุดที่สามารถตรวจได้ เท่ากับ 1 ng/µl และไม่เกิดปฏิกิริยาข้ามกลุ่มกับเชื้อส่วนใหญ่ของ Mycobacterium แม้ว่าเทคนิค RPA/SYBR ที่ได้พัฒนาขึ้น มีขั้นตอนการทดสอบที่ทำง่าย ไม่ซับซ้อน ให้ผลการทดสอบที่รวดเร็ว และสามารถอ่านผลได้ด้วยตาเปล่า และไม่จำเป็นต้องอาศัยเครื่องมือที่จำเพาะ ซึ่งเหมาะสำหรับนำมาใช้ตรวจคัดกรองเบื้องต้นในการวินิจฉัยเชื้อ MAC ในห้องปฏิบัติการในโรงพยาบาลขนาดเล็ก หรือห้องปฏิบัติการภาคสนาม อย่างไรก็ตาม ควรมีการศึกษาพัฒนาความจำเพาะเพิ่มเติม เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของเทคนิคดังกล่าวในอนาคต
dc.description.abstractalternative	Infections caused by Mycobacterium avium complex (MAC) has been increased globally, including Thailand, owing to the rising in immunocompromised patients. A current diagnosis, based on culture and biochemical tests, is time-consuming. Furthermore, it is not enabled to differentiate MAC in a species level, particularly between the most common isolated MAC, Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare. Thus, this study aimed to develop Recombinase Polymerase Amplification combined with a SYBR Green I, called RPA/SYBR, for diagnosis of MAC. The RPA/SYBR was depended on isothermal amplification directed by specific primers to MAC, M. avium and M. intracellulare, and was immediately read out by a naked eye after addition of a SYBR Green I. After examined with 120 DNA samples of MAC, RPA/SYBR was capable of differentiating between M. avium and M. intracellulare effectively. RPA/SYBR shown 100% and over 80.7% of sensitivity and specificity, respectively, and an excellent correlation (Kappa ≥ 0.801) when compared with nucleotide sequencing. While analyzing with PCR, RPA/SYBR shown over 89.2% and over 97.5% of sensitivity and specificity, respectively, and an excellent correlation (Kappa ≥ 0.863). Besides, a limit of detection of RPA/SYBR was 1 ng/µl, and there were no cross-reactions with most of the Mycobacterium species. Although, the developed RPA/SYBR was simple, rapid, easy for read out by a naked eye without the specific instruments, which is proper for a screening diagnosis of MAC in small healthcare settings or field laboratories. However, further development to improve a specificity should be concerned, in order to raise the efficiency of RPA/SYBR in future.
dc.language.iso	th
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.relation.uri	http://doi.org/10.58837/CHULA.THE.2019.1151
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.subject	มัยโคแบคทีเรียมเอเวียม
dc.subject	การวินิจฉัยโรคระดับโมเลกุล
dc.subject	Mycobacterium avium
dc.subject	Molecular diagnosis
dc.subject.classification	Immunology and Microbiology
dc.title	การพัฒนาเทคนิค RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION เพื่อตรวจหาเชื้อ Mycobacterium avium COMPLEX ด้วยตาเปล่า
dc.title.alternative	Development of recombinase polymerase amplification for naked eye detection of Mycobacterium avium Complex
dc.type	Thesis
dc.degree.name	วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
dc.degree.level	ปริญญาโท
dc.degree.discipline	วิทยาศาสตร์ระดับโมเลกุลทางจุลชีววิทยาทางการแพทย์และวิทยาภูมิคุ้มกัน
dc.degree.grantor	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.email.advisor	Panan.P@Chula.ac.th
dc.subject.keyword	Mycobacterium
dc.subject.keyword	MAC
dc.subject.keyword	Recombinase Polymerase Amplification
dc.subject.keyword	SYBR Green I
dc.subject.keyword	RPA/SYBR
dc.identifier.DOI	10.58837/CHULA.THE.2019.1151