การพัฒนาเทคนิค RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION และ HELICASE DEPENDENT ISOTHERMAL AMPLIFICATION สำหรับตรวจจีโนไทป์ของเอนไซม์ EXTENDED-SPECTRUM β-LACTAMASE ที่สร้างจากเชื้อ Escherichia coli ในสถาบันมะเร็งแห่งชาติ ประเทศไทย

ธัชภร อัศวคงคารัตน์

dc.contributor.advisor	นันทรี ชัยชนะวงศาโรจน์
dc.contributor.author	ธัชภร อัศวคงคารัตน์
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสหเวชศาสตร์
dc.date.accessioned	2020-11-11T09:51:15Z
dc.date.available	2020-11-11T09:51:15Z
dc.date.issued	2562
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/69392
dc.description	วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2562
dc.description.abstract	เชื้อ Escherichia coli ที่สร้างเอนไซม์ Extended-spectrum β-lactamase (ESBLs) เป็นปัญหาสำคัญที่พบในโรงพยาบาลทั่วโลก การตรวจจีโนไทป์ของเอนไซม์ ESBLs เป็นวิธีที่สำคัญและมีประโยชน์ในการควบคุมการแพร่กระจายของเชื้อดื้อยาและการเลือกใช้ยาต้านจุลชีพอย่างเหมาะสม การศึกษานี้มุ่งหวังจะพัฒนาเทคนิค Multiplex Recombinase polymerase amplification (Multiplex RPA) และ Helicase dependent amplification (HDA) สำหรับตรวจหายีนดื้อยา blaCTX-M, blaOXA, blaSHV และ blaTEM ในเชื้อ E. coli ในสถาบันมะเร็งแห่งชาติ ประเทศไทย เชื้อ E. coli จำนวน 144 ตัวอย่างที่แยกได้จากสิ่งส่งตรวจภายในงานจุลชีววิทยา สถาบันมะเร็งแห่งชาติ ช่วงระหว่างเดือนกุมภาพันธ์ 2017 ถึงเดือนกันยายน 2018 ถูกนำมาทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพและตรวจคัดกรองการสร้างเอนไซม์ ESBLs ด้วยวิธี Disk diffusion ตามวิธีมาตรฐานของ CLSI ปี ค.ศ. 2017 เชื้อที่สร้างเอนไซม์ ESBLs จำนวน 95 ตัวอย่าง พบดื้อยาสูงสุดในยา Ampicillin (100%), Cefotaxime (100%), Cefdinir (100%) และ Ceftriaxone (99.9%) และเชื้อ E. coli จำนวน 144 ตัวอย่าง มียีน blaCTX-M (100%) รองลงมาคือ blaTEM (42.1%), blaOXA (30.5%) และ blaSHV (2.1%) ตามลำดับ โดยเป็นยีน ESBLs ชนิด CTX-M-15 สูงสุด (51.1%) รองลงมาคือ CTX-M-55 (18.1%), CTX-M-27 (17.0%), CTX-M-14 (14.9%) และชนิดอื่น ๆ คือ TEM-127 (1.1%), TEM-215 (1.1%), OXA-16 (2.1%) และ SHV-18 (2.1%) เชื้อที่พบยีน blaCTX-M-15 มีความสัมพันธ์กับการดื้อยา Gentamicin, Levofloxacin และ Amoxicillin/ Clavulanic acid เพิ่มมากขึ้น และเชื้อที่พบยีน blaCTX-M-55 มีความสัมพันธ์กับการดื้อยา Ceftazidime และ Gentamicin เพิ่มมากขึ้น เทคนิค Multiplex RPA สามารถเพิ่มปริมาณยีน blaCTX-M, blaOXA และ blaSHV ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 25 นาที และเทคนิค HDA สามารถเพิ่มปริมาณยีน blaTEM ได้ที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที ขีดจำกัดต่ำสุดในการตรวจหายีน blaCTX-M, blaOXA, และ blaSHV ด้วยเทคนิค Multiplex RPA เท่ากับ 5, 0.5 และ 0.5 นาโนกรัม ตามลำดับ และเทคนิค HDA สำหรับการตรวจหายีน blaTEM เท่ากับ 50 นาโนกรัม เมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิค PCR พบว่าเทคนิค Multiplex RPA ที่พัฒนาขึ้นมีค่าความไวและความจำเพาะเท่ากับ 100% เทคนิค Multiplex RPA เป็นเทคนิคการตรวจที่รวดเร็ว มีค่าความไวและความจำเพาะสูง เหมาะกับการตรวจหายีนสร้างเอนไซม์ ESBLs ในห้องปฏิบัติการที่มีเครื่องมือจำกัด
dc.description.abstractalternative	Escherichia coli producing extended-spectrum β-lactamase (ESBLs) is a major problem in hospitals around the world. ESBLs genotyping is important and useful for surveillance, control of antimicrobial resistant spreading and rapid selection of appropriate treatments. This study aimed to develop multiplex RPA and HDA techniques for blaCTX-M, blaOXA, blaSHV and blaTEM detections in E. coli. Antibiotic susceptibility and ESBL confirmatory testing were determined by disk diffusion method according to the CLSI guidelines with 144 E. coli samples collected from various specimens in the Department of Microbiology, National Cancer Institute of Thailand during February 2017 to September 2018. The high frequency of drug resistance in 95 ESBLs isolates were Ampicillin (100%), Cefotaxime (100%), Cefdinir (100%) and Ceftriaxone (99.9%). All 95 ESBLs producing E. coli had blaCTX-M (100%) followed by 42.1% of blaTEM, 30.5% of blaOXA and 2.1% of blaSHV, respectively. The frequency of CTX-M-15 was predominate (51.1%) followed by CTX-M-55 (18.1%), CTX-M-27 (17.0%), CTX-M-14 (14.9%). Other subtypes were TEM-127 (1.1%), TEM-215 (1.1%), OXA-16 (2.1%), and SHV-18 (2.1%). E. coli harbouring blaCTX-M-15 significantly resist with Gentamicin, Levofloxacin and Amoxicillin/Clavulanic acid. E. coli harbouring blaCTX-M-55 significantly resist with Ceftazidime Gentamicin. The multiplex RPA was successfully amplified blaCTX-M, blaOXA, and blaSHV genes at 37 ºC within 25 min. The blaTEM gene was detected by HDA at 65 ºC for 30 min. The limit of detection for blaCTX-M, blaOXA, and blaSHV genes were 5, 0.5 and 0.5 ng, respectively, and at 50 ng for blaTEM gene. In comparison to PCR, multiplex RPA had both sensitivity and specificity of 100%. The developed multiplex RPA is promising tools for rapid, sensitive and specific identification of ESBLs genes in laboratory with limited resources.
dc.language.iso	th
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.relation.uri	http://doi.org/10.58837/CHULA.THE.2019.1152
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.subject	เอสเคอริเคียโคไล
dc.subject	การดื้อยาในจุลินทรีย์
dc.subject	Escherichia coli
dc.subject	Drug resistance in microorganisms
dc.subject.classification	Immunology and Microbiology
dc.title	การพัฒนาเทคนิค RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION และ HELICASE DEPENDENT ISOTHERMAL AMPLIFICATION สำหรับตรวจจีโนไทป์ของเอนไซม์ EXTENDED-SPECTRUM β-LACTAMASE ที่สร้างจากเชื้อ Escherichia coli ในสถาบันมะเร็งแห่งชาติ ประเทศไทย
dc.title.alternative	Development of recombinase polymerase amplification and helicase dependent isothermal amplification for genotypic detection of extended-spectrum β-lactamase - producing Escherichia coli in national cancer institute, Thailand
dc.type	Thesis
dc.degree.name	วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
dc.degree.level	ปริญญาโท
dc.degree.discipline	วิทยาศาสตร์ระดับโมเลกุลทางจุลชีววิทยาทางการแพทย์และวิทยาภูมิคุ้มกัน
dc.degree.grantor	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.email.advisor	nuntaree@gmail.com
dc.subject.keyword	ESCHERICHIA COLI
dc.subject.keyword	ESBLS
dc.subject.keyword	MULTIPLEX RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION
dc.subject.keyword	HELICASE DEPENDENT AMPLIFICATION
dc.identifier.DOI	10.58837/CHULA.THE.2019.1152