การเพิ่มประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อแบคทีเรียก่อโรคของแบคทีริโอซินจาก bacillus licheniformis ที่แยกได้จากระบบทางเดินอาหารของกุ้ง

แพรทิพย์ คล้ายเจริญสุข

dc.contributor.advisor	เขมาภรณ์ บุญบำรุง
dc.contributor.author	แพรทิพย์ คล้ายเจริญสุข
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสหเวชศาสตร์
dc.date.accessioned	2022-07-01T05:42:30Z
dc.date.available	2022-07-01T05:42:30Z
dc.date.issued	2564
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/79143
dc.description	วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2564
dc.description.abstract	การเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำเพื่อเป็นแหล่งอาหาร มีผลต่อความมั่นคงทางอาหารและโภชนาการของมนุษย์ โดยกุ้งทะเลจัดเป็นสัตว์น้ำเศรษฐกิจอันดับหนึ่งของไทย ตั้งแต่ปี พ.ศ. 2534 เป็นต้นมา เนื่องจากเป็นสัตว์น้ำที่ได้รับความนิยมบริโภคทั้งในประเทศและต่างประเทศทั่วโลก แต่ในปี พ.ศ. 2555-2556 การเลี้ยงกุ้งเริ่มประสบปัญหาโรคระบาดอย่างหนักจากอาการตายด่วนเนื่องจากตับและตับอ่อนวายเฉียบพลัน (Early mortality syndrome/ acute hepatopancreatic necrosis disease : EMS/AHPND) ทําให้เกิดความเสียหายต่อเกษตรกรและส่งผลกระทบต่อภาคอุตสาหกรรม รวมไปถึงสูญเสียส่วนแบ่งการตลาดและมูลค่าการส่งออกกุ้งทะเลเป็นอย่างมาก ต่อมาได้มีการพัฒนาจุลินทรีย์ ปม.1 ที่เป็นโพรไบโอติกในกลุ่มบาซิลัส เพื่อลดอัตราการเกิดโรค ซึ่งเชื้อ B. licheniformis ที่รวมในกลุ่มโพรไบโอติกนี้ มีความสามารถสร้างแบคทีริโอซินที่ยับยั้งการเจริญของเชื้อก่อโรคได้ มีคุณสมบัติทนความร้อน 100 °C ทำงานได้ดีในค่าความเป็นกรด-ด่างกว้าง จึงเป็นที่น่าสนใจในการศึกษาสภาวะที่เหมาะสมเพื่อเพิ่มปริมาณการสร้างแบคทีริโอซินของเชื้อ B. licheniformis และประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อก่อโรค จากการทดสอบเพาะเลี้ยงเชื้อ B. licheniformis ในอาหารเหลว Tryptic Soy Broth มีความเข้มข้นของเชื้อเป็น 106 CFU/มิลลิลิตร ในสภาวะที่ปรับเปลี่ยนอุณหภูมิ ช่วงเวลา และความเข้มข้นของเกลือที่ต่างกัน ผลการทดสอบประสิทธิภาพการยับยั้งเชื้อก่อโรคในกุ้งด้วยวิธี Total plate count พบว่า ในน้ำเลี้ยงเชื้อ (Cell Free Supernatant: CFS) สามารถยับยั้งเชื้อทดสอบได้แก่ เชื้อ Vibrio alginolyticus และ Vibrio parahaemolyticus ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่เป็นสาเหตุของโรคตับและตับอ่อนวายเฉียบพลันในกุ้งได้ดี เมื่อเพาะเลี้ยงเชื้อ B. licheniformis ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 72 ชั่วโมง และเลี้ยงในอาหารเหลว TSB ที่มีเกลือความเข้มข้น 2.5% และเมื่อเลี้ยง B. licheniformis ร่วมกับเซลล์ของเชื้อทดสอบที่ถูกทำให้ตายด้วยความร้อน พบว่าน้ำเลี้ยงเชื้อยังคงมีประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อทดสอบ จากนั้นตรวจวิเคราะห์ประสิทธิภาพการทำลายเซลล์ของแบคทีเรียก่อโรคของน้ำเลี้ยงเชื้อด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอนพบว่าส่วนที่ห่อหุ้มเซลล์ของเชื้อทดสอบมีลักษณะเป็นรู นอกจากนี้พบว่าสารยับยั้งในน้ำเลี้ยงเชื้อที่เกิดจากการเพาะเลี้ยงและจาก B. licheniformis ร่วมกับเซลล์ V. alginolyticus ที่ถูกทำให้ตายด้วยความร้อน มีความสามารถทำให้เซลล์ของเชื้อทดสอบมีขนาดเล็กลง และลดการเกาะกลุ่มของเชื้อทดสอบได้ดี ผลจากการวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนในน้ำเลี้ยงเชื้อ (Cell-Free Supernatant) ที่ได้จากการคัดเลือกโปรตีนให้มีน้ำหนักไม่เกิน 10 kDa และวิเคราะห์ด้วยเทคนิค liquid chromatography- mass spectrometry (LC-MS/MS) พบสายเปปไทด์ที่ค่า Denovo score ร้อยละ 70 ขึ้นไป จำนวน 617 ลำดับ โดยมีถึง 349 เปปไทด์ที่มีความน่าจะเป็น antimicrobial peptide โดยมี 8 เปปไทด์มีคุณสมบัติคล้ายแบคทีริโอซินในกลุ่มแลนติไบโอติก ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าเชื้อ Bacillus licheniformis ที่แยกจากระบบทางเดินอาหารของกุ้ง สามารถสร้างสารที่มีคุณสมบัติยับยั้งเชื้อก่อโรคตับและตับอ่อนวายเฉียบพลันในกุ้ง โดยการเพิ่มประสิทธิภาพจากการปรับสภาวะการเพาะเลี้ยง และเทคนิคการเลี้ยงร่วม จึงเป็นที่น่าสนใจนำมาพัฒนาและปรับใช้เพื่อแก้ปัญหาโรคตายด่วนในกุ้งอย่างยั่งยืนด้วยวิธีการทางชีวภาพจากการใช้เปปไทด์ต้านจุลชีพ อีกทั้งเป็นการลดปัญหาการดื้อยาปฏิชีวนะที่เกี่ยวข้องกับอุตสาหกรรมเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ
dc.description.abstractalternative	Aquaculture as a food source affects food security and human nutrition. Marine shrimp has been ranked as the number one economic aquatic animal in Thailand since 1991. Due to this, it is a popular aquatic animal for consumption both domestically and internationally. However, shrimp farming began to be disrupted by severe disease outbreaks in 2013, including Early Mortality Syndrome (EMS) and Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (EMS/AHPND), causing damage to farmers and affecting the industrial sector, including the loss of market share and the value of marine shrimp exports. For this reason, the Samut Sakhon Coastal Fisheries Research and Development Center has selected microorganisms to produce PM.1, a probiotic from the genus Bacillus, to reduce the incidence of such diseases. Bacteriocin, produced by Bacillus licheniformis, has inhibited pathogen growth. It was heat-resistant up to 100 °C and performed well in a wide pH range. In this study, B. licheniformis was cultured in Tryptic Soy Broth (TSB) at a 106 CFU/ml concentration at various conditions that affect bacteriocin production, i.e., incubation time, temperature, and salt concentration in the medium. The cell-free supernatant was collected and tested for efficiency in inhibiting pathogens in shrimp, including Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus, by the Total plate count method. The cell-free supernatant (CFS) of B. licheniformis was shown to have the most effective inhibiting activity after 72 hours of cultured B. licheniformis at 30 °C in TSB liquid medium containing 2.5% salt concentration. The inhibition activity is demonstrated by the CFS of B. licheniformis co-cultured with the dead cells of V. alginolyticus and V. parahaemolyticus. The cytotoxic effect of CFS was demonstrated by the formation of pores on the cell membrane of pathogenic bacteria, which was observed using a scanning electron microscope. Moreover, the CFS of B. licheniformis in co-culture with killed cells of V. alginolyticus affected V. parahaemolyticus by reducing the cell size and aggregation. The amino acid sequence analysis in cell-free supernatant was selected by molecular weight less than 10 kDa and analyzed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS). The result found 617 peptide sequences, focusing on Denovo scores of more than 70%. The probable antimicrobial peptides were 379 peptide sequences, especially eight peptide sequences found to be lantiobic-like bacteriocin sequences. In this study, the CFS of B. licheniformis, which was isolated from shrimp's intestine, found inhibition activity on EMS/AHPND pathogens. The efficiency of inhibitory activity was increased by adjusting the culture conditions and co-culture techniques. Therefore, it is interesting to develop and apply a biological method to solve the problem of EMS/AHPND in shrimp sustainably through a biological method using an antimicrobial peptide. It also reduces the antibiotic resistance issue associated with the aquaculture industry.
dc.language.iso	th
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.relation.uri	http://doi.org/10.58837/CHULA.THE.2021.864
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.subject	แบคทีริโอซิน
dc.subject	กุ้ง -- โรค
dc.subject	โรคเกิดจากแบคทีเรียในสัตว์
dc.subject	Bacteriocins
dc.subject	Shrimps -- Diseases
dc.subject	Bacterial diseases in animals
dc.subject.classification	Immunology and Microbiology
dc.subject.classification	Agricultural and Biological Sciences
dc.title	การเพิ่มประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อแบคทีเรียก่อโรคของแบคทีริโอซินจาก bacillus licheniformis ที่แยกได้จากระบบทางเดินอาหารของกุ้ง
dc.title.alternative	Enhancement of bacterial pathogen inhibition by bacteriocin from bacillus licheniformis isolated from intestinal tract of shrimp
dc.type	Thesis
dc.degree.name	วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
dc.degree.level	ปริญญาโท
dc.degree.discipline	วิทยาศาสตร์ระดับโมเลกุลทางจุลชีววิทยาทางการแพทย์และวิทยาภูมิคุ้มกัน
dc.degree.grantor	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.identifier.DOI	10.58837/CHULA.THE.2021.864