การวิเคราะห์จีโนมในไมโตคอนเดรียของอะแคนธามีบาเพื่อการจำแนกจีโนไทป์โดยวิธีใหม่ การศึกษาสายวิวัฒนาการและการวินิจฉัย : รายงานการวิจัยฉบับสมบูรณ์ปีที่ 1

สมชาย จงวุฒิเวศย์; จตุรงค์ พุทธพรทิพย์; ไพโรจน์ ธีรนัยพงศ์; อุรัสยา พัฒนวงศ์

dc.contributor.author	สมชาย จงวุฒิเวศย์
dc.contributor.author	จตุรงค์ พุทธพรทิพย์
dc.contributor.author	ไพโรจน์ ธีรนัยพงศ์
dc.contributor.author	อุรัสยา พัฒนวงศ์
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะแพทยศาสตร์. ภาควิชาปรสิตวิทยา
dc.date.accessioned	2022-09-07T03:56:25Z
dc.date.available	2022-09-07T03:56:25Z
dc.date.issued	2562
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/80462
dc.description.abstract	โปรโตซัวที่ดำรงชีพเป็นอิสระในจีนัสอะแคนธามีบาสามารถก่อให้เกิดการติดเชื้อที่รุนแรงและถึงแก่ชีวิตในคนได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งภาวะกระจกตาอักเสบและภาวะสมองและเยื่อหุ้มสมองอักเสบ ในธรรมชาติอะแคนธามีบาดำรงอยู่ในสภาวะแวดล้อมที่หลากหลาย อาทิ ในดิน ฝุ่น ระบบทำความเย็น น้ำเสียและแหล่งน้ำในธรรมชาติ เป็นต้น การจำแนกจีโนไทป์ของอะแคนธามีบาในปัจจุบันอาศัยการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของไดแอกโนสติกแฟรกเม้นต์ 3 (DF3) ในยีนไรโบโซมหน่วยย่อยขนาดเล็กซึ่งมักมีปัญหาในการจัดเรียงลำดับนิวคลีโอไทด์ ดังนั้นการค้นหายีนอื่นจึงมีความจำเป็นเพื่อการจำแนกจีโนไทป์ของอะแคนธามีบา เช่น ยีนในจีโนมของไมโตคอนเดรีย ทั้งนี้จีโนมในไมโตคอนเดรียของอะแคนธามีบามีขนาดประมาณ 39.2 กิโลเบสถึง 41.6 กิโลเบส ประกอบด้วยยีนอย่างน้อย 55 ชนิดซึ่งยีนหนึ่งคือยีนสำหรับไซโตโครมบี ขอบเขตของการวิจัยนี้ครอบคลุมการศึกษาระบาดวิทยาของอะแคนธามีบาในแหล่งน้ำในธรรมชาติของประเทศไทยและการวิเคราะห์จีโนมของไมโตคอนเดรียของอะแคนธามีบาจากจีโน ไทป์ที่ชัดเจน ในการศึกษาอุบัติการณ์ของอะแคนธามีบาได้ทำการสำรวจแหล่งน้ำจืด 40 แห่งที่อยู่ใน 10 จังหวัดใน 5 ภูมิภาคของประเทศไทย ได้แก่ จังหวัดอุตรดิตถ์ ลำพูน สกลนคร ชัยภูมิ สระบุรี สุพรรณบุรี ปราจีนบุรี ระยอง ระนอง และพัทลุง โดยใช้ตัวอย่างทั้งสิ้น 4,000 ตัวอย่าง ทำการเพาะเลี้ยงโดยใช้วุ้นร้อยละ 1.5 ในจานเพาะเลี้ยงที่ มีแบคทีเรียเอสเชอริเชียโคไลที่ผ่านความร้อน ผลการศึกษาพบว่าสามารถตรวจพบอะแคนธามีบาจากแหล่งน้ำใน ทุกจังหวัดที่สำรวจ โดยมีอัตราการตรวจพบเฉลี่ยร้อยละ 14.43 ของตัวอย่างทั้งหมด อะแคนธามีบาที่พบมีทุกกลุ่ม จำแนกตามลักษณะของระยะซีสต์ซึ่งซีสต์ที่อยู่ในกลุ่ม 2 พบมากที่สุดคือร้อยละ 67.42 รองลงมาคือซีสต์ที่อยู่ใน กลุ่ม 3 และกลุ่ม 1 ตามลำดับ ตัวอย่างร้อยละ 22.01 มีซีสต์ที่อยู่ปะปนกันมากกว่า 1 กลุ่ม จากการวิเคราะห์ส่วน DF3 ในยีนไรโบโซมหน่วยย่อยขนาดเล็กจาก 214 ตัวอย่างพบว่าประกอบด้วยแฮปโปลไทป์ต่างกัน 74 แบบ อย่างไรก็ตามเมื่อวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ในยีนไรโบโซมหน่วยย่อยขนาดเล็กครอบคลุม 2.0 กิโลเบสถึง 2.2 กิโลเบส พบว่าตัวอย่างเหล่านี้สามารถจำแนกเป็นจีโนไทป์ได้ 16 แบบ ได้แก่ จีโนไทป์ T2/6b, T3, T4B, T4C, T4D, T4F, T4G, T4Neff, T5, T11, T12, T13, T17, T18, T20 และ New#1 ซึ่งเป็นจีโนไทป์ใหม่ เป็นที่น่าสังเกตว่าตัวอย่างอะแคนธามีบาทุกตัวอย่างจากผู้ป่วยกระจกตาอักเสบและตัวอย่างจากแหล่งน้ำในธรรมชาติที่มีจีโนไทป์ T4B, T4C, T4D และ T4G มีคุณลักษณะทนความร้อน โดยสามารถเจริญได้ที่อุณหภูมิ 42 องศาเซลเซียส ในการเพิ่มปริมาณดีเอนเอโดยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรสเพื่อให้ได้ผลผลิตสายยาวจำนวน 6 ส่วนที่ครอบคลุมความความยาวตลอดทั้งจีโนมของไมโตคอนเดรียของอะแคนธามีบาโดยแต่ละส่วนมีความยาว 4.3 กิโลเบสถึง 9.4 กิโลเบสจาก 20 ตัวอย่างที่มีจีโนไทป์ต่างกันได้เป็นผลสำเร็จเพื่อใช้ในการเป็นดีเอนเอต้นแบบสำหรับการหาลำดับ นิวคลีโอไทด์ในการศึกษาต่อไป สำหรับการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ในยีนสำหรับไซโตโครมบีครอบคลุมความยาว 1,155 เบสจาก 65 ตัวอย่าง พบว่ามีการแทนที่ของนิวคลีโอไทด์จำนวนมากซึ่งสามารถใช้จำแนกจีโนไทป์โดยการวิเคราะห์สายใยพันธุกรรมได้เป็นจีโนไทป์ต่าง ๆ ที่สอดคล้องกับการจำแนกโดยใช้ข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ใน ยีนไรโบโซมหน่วยย่อยขนาดเล็ก โดยสรุปพบว่าแหล่งน้ำในธรรมชาติในประเทศไทยมีอะแคนธามีบาหลากหลายจีโนไทป์ปะปนอยู่และพบว่ายีนในจีโนมของไมโตคอนเดรียสามารถใช้เป็นเป้าหมายทางเลือกในการจำแนกจีโนไทป์ของอะแคนธามีบาได้	en_US
dc.description.abstractalternative	Free-living protozoa in the genus Acanthamoeba can cause severe and lethal infections in humans, especially keratitis and meningoencephalitis. In nature, acanthamoebae occupy diverse ecological niche such as soil, dust, cooling systems, sewage and natural water sources. To date, genotype assignment of Acanthamoeba is solely relied on sequence analysis of the diagnostic fragment 3 (DF3) of the nuclear small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) gene that can be compromised by unreliable sequence alignment. Therefore, searching for alternative gene target such as loci in mitochondrial genome is promising for genotyping of Acanthamoeba. The mitochondrial genomes of Acanthamoeba comprised ~39.2 kb to 41.6 kb in which at least 55 genes have been identified, one of which is the gene encoding cytochrome b. The scopes of this study include epidemiology of Acanthamoeba in natural water sources in Thailand and analysis of the mitochondrial genome of certain genotypes. To determine the prevalence and distribution of Acanthamoeba, 4,000 water samples from 40 natural fresh water sources located in 10 provinces (Uttaradit, Lamphun, Sakon Nakhon, Chaiyaphum, Saraburi, Suphan Buri, Prachinburi, Rayong, Ranong and Phatthalung) in 5 regions of Thailand were collected and searched for Acanthamoea by cultivation with 1.5% non-nutrient agar plate lawn with heatinactivated Escherichia coli. Results revealed that Acanthamoeba could be isolated from the water sources of all these provinces with an average recovery rate of 14.43%. All three morphological groups of Acanthamoeba cysts were recovered, characterized by the most common group II accounting for 67.42% of positive samples, followed by groups III and I. Mixed morphological groups were also common among isolates, representing 22.01% of samples. Based on analysis of the DF3 region in the SSU rRNA gene, 74 distinct haplotypes were found among 214 isolates. However, further sequencing of the SSU rRNA gene encompassing 2.0-2.2 kb has validated that these haplotypes could be assigned to 16 genotypes including a novel genotype, i.e. T2/6b, T3, T4B, T4C, T4D, T4F, T4G, T4Neff, T5, T11, T12, T13, T17, T18, T20 and New#1. Interestingly, all clinical isolates from keratitis patients and isolates from natural water sources bearing genotypes T4B, T4C, T4D and T4G exhibited thermotolerance phenotype with the capability of growing at 42°C in culture condition. Meanwhile, long PCR amplification of 6 overlapping fragments, measured 4.3-9.4 kb for each fragment, encompassing the complete mitochondrial genomes of 20 distinct genotypes of Acanthamoeba was accomplished for deploying as sequencing templates in a subsequent study. Sequencing of the complete cytochrome b gene, spanning 1,155 bp of 65 isolates has revealed substantial nucleotide substitutions that could be phylogentically assigned to distinct genotypes corresponding to genotyping based on the SSU rRNA locus. In conclusion, natural water sources in Thailand contained various genotypes of Acanthamoeba and the mitochondrial cytochrome b gene is an alternative target for genotyping of Acanthamoeba.	en_US
dc.description.sponsorship	ได้รับทุนอุดหนุนการวิจัยจากงบประมาณแผ่นดิน ประจำปี 2561	en_US
dc.language.iso	th	en_US
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.subject	อะแคนทามีบา -- ไทย	en_US
dc.title	การวิเคราะห์จีโนมในไมโตคอนเดรียของอะแคนธามีบาเพื่อการจำแนกจีโนไทป์โดยวิธีใหม่ การศึกษาสายวิวัฒนาการและการวินิจฉัย : รายงานการวิจัยฉบับสมบูรณ์ปีที่ 1	en_US
dc.title.alternative	Insights into the mitochondrial genomes of Acanthamoeba : implications for novel genotyping, phylogeny and diagnosis	en_US
dc.type	Technical Report	en_US