การผลิตและทดสอบรีคอมบิแนนท์ scFv-Fc ต่อ NOTCH1 และ NOTCH2 ที่ผลิตโดยเซลล์ไลน์ CHO-K1 เพื่อยับยั้งวิถีสัญญาณ Notch ในเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาว

ธนวันต์ อาชาวงศ์

dc.contributor.advisor	ธนาภัทร ปาลกะ
dc.contributor.author	ธนวันต์ อาชาวงศ์
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
dc.date.accessioned	2022-10-06T07:49:36Z
dc.date.available	2022-10-06T07:49:36Z
dc.date.issued	2563
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/80600
dc.description	โครงงานเป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ปีการศึกษา 2563	en_US
dc.description.abstract	วิถีสัญญาณ Notch เป็นวิถีสัญญาณภายในเซลล์ที่มีในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยน้ำนมซึ่งทำหน้าที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ การเพิ่มจำนวน และการตายของเซลล์ ความผิดปกติของการส่งวิถีสัญญาณ Notch นำไปสู่การเกิดมะเร็งหลายชนิด โดยพบการกลายพันธุ์ของยีนที่แสดงออกโปรตีน NOTCH1 มากกว่า 50% ในผู้ป่วยมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด T cell (T cell acute lymphoblastic leukemia; T-ALL) โดยเฉพาะอย่างยิ่งการกลายพันธุ์ของยีนแสดงออกโปรตีน HD พบมากกว่า 40% ของผู้ป่วยโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด T cell ซึ่งส่งผลให้วิถีสัญญาณ Notch เพิ่มขึ้นอย่างมาก หนึ่งในวิธียับยั้งวิถีสัญญาณ Notch ที่เพิ่มขึ้นอย่างมากนี้คือการใช้ gamma secretase inhibitor (GSI) อย่างไรก็ตามการใช้ GSI ก็ยังมีข้อเสียคือการมีสับสเตรทหลายชนิด (pan-inhibitor activity) เช่น APP ERBBP4 E-cadherin ephrinB2 และ CD44 เป็นต้น จึงเป็นสาเหตุที่การรักษาด้วย GSI ผลข้างเคียงตามมา การใช้รีคอมบิแนนท์แอนติบอดี scFv-Fc ที่มีความจำเพาะอย่างมากต่อ negative regulatory region (NRR) ของ NOTCH1 และ NOTCH2 (αN1 scFv-Fc และ αN2 scFv-Fc) จึงเป็นทางเลือกที่มีความหวังในการรักษาโรค T-ALL ที่เกิดจากการกลายพันธุ์ที่ยีน NOTCH การศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อผลิตรีคอมบิแนนท์แอนติบอดีทั้ง 2 ชนิดจากเซลล์ไลน์ CHO-K1 เพื่อทดสอบประสิทธิภาพการรักษาในเซลล์ไลน์มะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด T cell ประกอบไปด้วยเซลล์ไลน์ Molt4 และ Jurkat ผลพบว่าเซลล์ไลน์ CHO-K1 ที่ผลิต αN1 scFv-Fc and αN2 scFv-Fc มีผลิตภาพจำเพาะ 16.20 และ 28.96 พิโคกรัมต่อเซลล์ต่อวัน ภายใน 7 วันของการผลิตตามลำดับ ผลิตภัณฑ์ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธีการคอลัมน์ โครมาโทกราฟีสัมพรรคภาพถูกตรวจสอบด้วย SDS-PAGE และ Western Blot นอกจากนี้ Molt4 และ Jurkat ยังตรวจพบการแสดงออกของ NOTCH1 และ NOTCH2 ซึ่งบ่งบอกถึงการส่งวิถีสัญญาณ Notch ภายในเซลล์ การทดลองที่ควรทำเพิ่มเติมคือการลดระดับของวิถีสัญญาณ Notch การลดความเป็นเซลล์มะเร็งต้นกำเนิด (cancer stemness) และการตายของเซลล์ในเซลล์ไลน์ Molt4 และ Jurkat จากการให้ αN1 scFv-Fc และ αN2 scFv-Fc จำเป็นต้องถูกศึกษาในอนาคต การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่ารีคอมบิแนนท์แอนติบอดีสามารถในไปใช้ในการยังยั้งวิถีสัญญาณ Notch ในเซลล์ไลน์มะเร็งเม็ดเลือดขาวได้อย่างมีประสิทธิภาพ และเป็นทางเลือกหนึ่งสำหรับการใช้ภูมิคุ้มกันบำบัดในการรักษารโรค T-ALL	en_US
dc.description.abstractalternative	Notch signaling is a highly conserved cellular signaling pathway in mammals which involves in cellular differentiation, proliferation and cell death. Dysfunctional Notch signaling is also oncogenic that drives various cancers. More than 50% of T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) patients harbor mutation in NOTCH1. In particular, mutation in the HD domain (at least 40% of T-ALL patients) results in hyperactivated Notch signaling. One of the effective approaches against the Notch gain-of-function mutation is gamma secretase inhibitor (GSI) treatment. However, gamma secretase has many substrates including APP, ERBBP4, E-cadherin, ephrinB2 and CD44, which may cause undesirable side effect by GSI treatment. The use of highly specific scFv-Fc antibodies targeting negative regulatory region (NRR) of NOTCH1 and NOTCH2, αN1 scFv-Fc and αN2 scFv-Fc, is a promising alternative approach in treating T-ALL with NOTCH mutation. In this study, these recombinant antibodies were produced from stable CHO-K1 cell line with batch cultivation in order to test the efficacy against leukemic cell lines including Molt4 and Jurkat. The results showed that the specific productivity of αN1 scFv-Fc and αN2 scFv-Fc CHO-K1 were 16.20 and 28.96 pg/(cell*day) within 7 days of culture, respectively. Purification steps using affinity chromatography results in scFv-Fc on SDS-PAGE and Western Blot. Both Molt4 and Jurkat express NOTCH1 and NOTCH2 indicating that Notch signaling is activated. For further experiment, decreased Notch signaling, leukemic cancer stemness and cell viability by αN1 scFv-Fc and αN2 scFv-Fc treated Molt4 and Jurkat will be evaluated. Study will provide evidence whether recombinant scFv-Fc specific for Notch NRR can be used to successfully inhibit Notch signaling in T-ALL cell lines. The result will provide additional immunotherapeutic choices for T-ALL treatment.	en_US
dc.language.iso	th	en_US
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.subject	ยีนมะเร็ง	en_US
dc.subject	มะเร็งเม็ดเลือดขาว -- แง่พันธุศาสตร์	en_US
dc.subject	รีคอมบิแนนต์โปรตีน	en_US
dc.subject	Oncogenes	en_US
dc.subject	Leukemia -- Genetic aspects	en_US
dc.subject	Recombinant proteins	en_US
dc.title	การผลิตและทดสอบรีคอมบิแนนท์ scFv-Fc ต่อ NOTCH1 และ NOTCH2 ที่ผลิตโดยเซลล์ไลน์ CHO-K1 เพื่อยับยั้งวิถีสัญญาณ Notch ในเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาว	en_US
dc.title.alternative	Production of recombinant scFv-Fc antibody to NOTCH1 and NOTCH2 from CHO-K1 cell line and their Notch signaling inhibitory ability in leukemia cell line	en_US
dc.type	Senior Project	en_US
dc.degree.grantor	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US