การทดสอบความแม่นยำของการตรวจวัดดัชนีการตกผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลต (โคซี่) เพื่อการวินิจฉัยโรคนิ่วในปัสสาวะ และการพัฒนานวัตกรรมวิธีการตรวจวัดปริมาณออกซาเลตในปัสสาวะโดยอาศัยอนุภาคนาโนควอนตัมดอท

Abstract

โรคนิ่วปัสสาวะเป็นภาวะที่มีก้อนนิ่วในระบบทางเดินปัสสาวะ ซึ่งเป็นปัญหาสุขภาพมายาวนานมาก ทั่วโลก และยิ่งมากขึ้นในประเทศเขตร้อน รวมทั้งประเทศไทย นิ่วปัสสาวะส่วนใหญ่เกิดขึ้นในไต เรียกว่า นิ่วไต ซึ่งปัจจุบันถือว่านิ่วไตเป็นหนึ่งในปัจจัยเสี่ยงสำคัญของโรคไตวายเรื้อรัง โดยทั่วไปนิ่วมีหลายชนิดแต่ที่พบมาก ที่สุดคือ นิ่วแคลเซี่ยมออกซาเลต เกิดจากการอิ่มตัวยวดยิ่งของปัสสาวะแล้วทำให้ตกผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลต ดังนั้น การวัดว่าปัสสาวะความสามารถในการตกผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลตได้มากน้อยเพียงใด จะสามารถ ประเมินความเสี่ยงต่อการเกิดนิ่วแคลเซี่ยมออกซาเลตในปัสสาวะได้ คณะวิจัยได้พัฒนาเทคนิคการตรวจวัด ดัชนีการตกผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลต (โคซี่) ขึ้นมาในปี ค.ศ. 2014 สำหรับคัดกรองโรคนิ่วแคลเซี่ยมออกซาเลตในปัสสาวะ ซึ่งได้ผลดี แต่กระบวนการตรวจวัดโคซี่ยังใช้เวลานาน ใช้เวลาตกผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลต 60 นาที การศึกษานี้จึงปรับวิธีการทำใหม่โดยลดเวลาตกผลึกลงเป็น 10 นาที จากนั้นวัดค่าโคซี่ด้วยวิธีใหม่นี้ใน ตัวอย่างปัสสาวะ 24 ชั่วโมง (n=302) จากกลุ่มผู้ป่วยนิ่วจำนวน 176 ราย และกลุ่มที่ไม่เป็นนิ่วจำนวน 129 ราย ค่าโคซี่ในปัสสาวะของกลุ่มผู้ป่วยนิ่วสูงกว่ากลุ่มไม่เป็นนิ่วอย่างมีนัยสำคัญ ผลการวิเคราะห์ ROC เพื่อ จำแนกคนที่เป็นนิ่วออกจากคนที่ไม่เป็นนิ่ว พบว่าวิธีโคซี่มีค่าพื้นที่ได้กราฟเท่ากับ 0.7651 (95% CI: 0.7124– 0.8178) สำหรับจำแนกคนเป็นนิ่วทั้งหมด และเท่ากับ 0.8839 (95% CI: 0.8115–0.9564) สำหรับจำแนก เฉพาะคนที่เป็นนิ่วแคลเซี่ยมออกซาเลต ผลการศึกษานี้ชี้ว่าวิธีโคซี่ที่พัฒนาขึ้นนี้มีความแม่นยำในการ วินิจฉัยโรคนิ่วปัสสาวะในระดับปานกลาง (moderately accurate: มีค่าพื้นที่ได้กราฟอยู่ระหว่าง 0.7-0.9) เมื่อกำหนดค่าปกติ (cutoff) ที่ 460 COM eqv. mg/day วิธีโคซี่นี้จะให้ค่าการวินิจฉัย sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value และ accuracy เท่ากับ 84%, 81%, 61%, 94% และ 82% ตามลำดับ ซึ่งเพียงพอที่จะนำมาใช้ในคลินิกจริงสำหรับคัดกรองได้ อีกปัญหาหนึ่งของ วิธีการทำโคซี่คือต้องใช้การปั่นเหวี่ยงเพื่อแยกตะกอนผลึกโคซี่ออกมาซึ่งการปั่นเหวี่ยงทำให้ต้องใช้เวลาเพิ่มขึ้น คณะผู้วิจัยจึงพัฒนาวิธีใหม่เพิ่มเติม เรียกว่า magnetic-assisted COCI (mCOCI) โดยมีแนวคิดว่าจะฝัง magnetic nanoparticles เข้าไปในผลึกโคซี่ แล้วแยกผลึกออกมาโดยใช้แรงแม่เหล็กแทนการใช้แรงปั่น เหวี่ยง แต่ผลการทดลองไม่เป็นไปตามที่คาดไว้ ถึงแม้ magnetic nanoparticles ถูกฝังเข้าไปในผลึกได้ แต่ การแยกผลึกด้วยแรงแม่เหล็กไม่มีประสิทธิภาพเท่าที่ควร เหตุผลหลักมาจากความแรงของแม่เหล็กในผลึกต่ำ มากจนไม่สามารถใช้แม่เหล็กดูดได้ดี นอกจากนี้คณะผู้วิจัยได้พยายามที่จะปรับปรุงวิธีโคซี่ให้ถูกลงและใช้งาน ง่ายขึ้น โดย เปลี่ยนจากการวัดปริมาณผลึกแคลเซี่ยมออกซาเลตจากการวัดด้วยค่าการดูดกลืนแสงช่วงคลื่น UV ที่ 215 nm มาเป็นช่วงคลื่น visible ที่ 470 nm วิธีที่พัฒนาขึ้นเพิ่มเติมจากโคซี่เดิมนี้ เรียกว่า chromogenic COCI (cCOCI) มีหลักการคือฝังสารสี Coomassie brilliant blue (CBB, R-250) เข้าไปใน ผลึกโคซี่ ทำให้ผลึกใหญ่ขึ้น ตกตะกอนได้ง่ายขึ้น และผลึกเปลี่ยนจากไม่มีสีเป็นสีฟ้า ผลึกสีฟ้าที่ได้จะล้างด้วย สารละลายอะซิติกแล้วละลายด้วย 2 N HCl จะได้เป็นสารละลายสีม่วงแดง วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 470 nm ผลการทดลองพบว่าค่า cCOCI ให้ผลสอดคล้องกับค่า COCI ซึ่งผลการศึกษาทำให้เชื่อว่า cCOCI น่าจะสามารถประยุกต์ใช้ในคลินิกได้ดีกว่าและถูกกว่า COCI เดิม อีกหนึ่งวัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้คือการพัฒนาวิธีใหม่สำหรับตรวจวัดปริมาณออกซาเลตในปัสสาวะ และในตัวอย่างอาหาร คณะผู้วิจัยได้พัฒนาขึ้นมา 2 วิธีที่มีหลักการต่างกัน คือ วิธีที่หนึ่งอาศัย quantum dot (QD) nanoparticles และลิแกนด์ที่จับจำเพาะกับออกซาเลต (oxalate-binding ligands) เรียกวิธีนี้ว่า QDbased oxalate test ซึ่งปัจจุบันสามารถสังเคราะห์ oxalate-binding ligands ได้แล้วและอยู่ระหว่างการ เชื่อมต่อกับ QD nanoparticles ส่วนวิธีที่สองวัดปริมาณออกซาเลตโดยอาศัยการทำงานของเอนไซม์ oxalate oxidase (OxO) และการสร้าง protein nanoparticles เป้าหมายที่พัฒนาวิธี enzymatic oxalate test นี้ขึ้นมา คือ เพื่อใช้เป็น point-of-care testing (POCT) ปัจจุบันคณะผู้วิจัยสามารถโคลน recombinant OxO (ยีนจากข้าวบาร์เลย์) ในยีส (Pichia pastoris) ได้แล้ว อยู่ในขั้นตอนการเพิ่มปริมาณให้ มากขึ้นเพื่อใช้ผลิต OxO-containing protein nanoparticles ในระหว่างนี้คณะผู้วิจัยได้พัฒนา POCT สำหรับการตรวจวัดกลูโคสขึ้นด้วย แนวคิดคือต้องการให้ 1 POCT test สามารถตรวจวัดได้พร้อมกันทั้งออก ซาเลตและกลูโคส ซึ่งจะมีประโยชน์มากสำหรับผู้ป่วยนิ่วให้สามารถรู้ได้ว่าอาหารที่กำลังจะรับประทานนั้นมี ปริมาณออกซาเลตและกลูโคสมากน้อยเพียงใด ทำให้สามารถเลี่ยงการรับประทานอาหารที่มีออกซาเลตและ น้ำตาลสูงได้ ซึ่งจะเป็นประโยชน์ต่อการป้องกันการเกิดนิ่วซ้ำในอนาคต และยังเป็นประโยชน์ต่อคนปกติทั่วไป ที่ต้องการเลี่ยงอาหารที่มีออกซาเลตและน้ำตาลสูงด้วย