การทำเอนไซม์ไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสให้บริสุทธิ์ โดยวิธีโครมาโทกราฟีแบบสัมพรรคภาพอิมมูโน

Abstract

ศึกษาการทำแอนติบอดีต่อเอนไซม์ไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจากซีรั่มกระต่ายให้บริสุทธิ์ โดยใช้วิธีการตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตที่ความเข้มข้นอิ่มตัว 45% และทำโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนด้วย DEAE-cellulose พบว่าที่ pH 6.5 แอนติบอดีต่อเอนไซม์ CGTase ไม่ยึดติดกับ DEAE-cellulose resin แอนติบอดีที่เตรียมได้มีความบริสุทธิ์จากการตรวจสอบโดยโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโทรโฟรีซิสแบบเอสดีเอส และมีความจำเพาะต่อเอนไซม์ CGTase โดยมีค่าไดเตอร์เท่ากับ 1:2 8 จากการวิเคราะห์ด้วยวิธี Ouchterlony immunodiffusion ได้ทดลองตรึงแอนติบอดีต่อเอนไซม์ CGTase เข้ากับตัวค้ำ CNBr-activated Sepharose 4 B เพื่อเตรียมแอนติบอดีคอลัมน์เพื่อใช้แยกเอนไซม์ CGTase ให้บริสุทธิ์ พบว่าตรึงแอนติบอดีเข้ากับตัวค้ำได้ 98% คิดเป็นปริมาณแอนติบอดี 4.9 มิลลิกรัมต่อตัวค้ำ 1 มิลลิลิตร สภาวะที่เหมาะสมในการแยกเอนไซม์ CGTase ให้ออกจากแอนติบอดีคอลัมน์คือ การใช้สารละลายแอมโมเนียมไฮดรอกไซด์ 50 mM, pH 10.5 ที่มีโซเดียมไธโอไซยาเนต 3.5 Mเป็นสารชะ ด้วยอัตราการชะ 0.1 มิลลิลิตรต่อนาทีที่อุณหภูมิห้อง เอนไซม์ CGTase ที่เตรียมได้มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 155 เท่า และ enzyme yield 45% เมื่อทำการแยกเอนไซม์ CGTase โดยโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโทรโฟรีซิสแบบไม่เสียสภาพ พบแถบโปรตีน 2 แถบ แต่จากการทำโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโทรโฟรรีซิสแบบเอสดีเอสจะเห็นแถบโปรตีนเพียงแถบเดียวและมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 72,000 ดาลตัน