การโคลนและศึกษาลักษณะยีนเดกซ์แทรนเนสจาก Arthrobacter sp. AG-2

Abstract

ได้แยกและหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนเดกซ์แทรนเนสจาก Arthrobacter sp. AG-2 ใช้ E. coli DH5alpha เป็นเซลล์เจ้าบ้าน โดยทำ Southern hybridization เพื่อติดตามยีนเดกซ์แทรนเนสและคัดเลือกโคลนโดยทำ Dot blot hybridization ด้วยดีเอ็นเอติดตาม DEX-probe ที่ได้จากปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสโดยใช้ไพรเมอร์ DEXFWD2 และ DEXREV ที่ออกแบบจากบริเวณอนุรักษ์ของยีนที่ประมวลรหัสสร้างเดกซ์แทรนเนสสามชนิด โคลนชิ้นดีเอ็นเอ BamHI ขนาด 1,977 คู่เบส โดยใช้ pGEM-7Zf(+) เป็นดีเอ็นเอพาหะ ระบุเป็น pSUDEX1 เมื่อเปรียบเทียบความเหมือนของ SUDEX1 พบว่ามีบางส่วนทางปลาย 5’ ของยีน sdx สร้างดีเอ็นเอติดตาม PB-probe จากชิ้นดีเอ็นเอ PstI-BamHI ทางปลาย 3’ ของ SUDEX1 ได้โคลนชิ้นดีเอ็นเอ SUDEX2 ที่เป็นส่วนปลาย3’ของยีน sdx จากการเปรียบเทียบความเหมือนไม่พบรหัสหยุด จึงสร้างดีเอ็นเอติดตาม BP-probeจากชิ้นดีเอ็นเอ BamHI-PstI ทางปลาย 3’ ของชิ้นดีเอ็นเอ SUDEX2 เพื่อใช้ติดตามชิ้นดีเอ็นเอส่วนที่เหลือของยีน sdx โคลนชิ้นดีเอ็นเอ SUDEX3 ได้ เมื่อวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้นดีเอ็นเอทั้งหมดที่โคลนได้พบกรอบอ่านรหัสเปิดของยีน sdx มีขนาด 1,899 คู่เบส ที่ประมวลรหัสสร้างโปรตีนประกอบด้วยกรดอะมิโนขนาด 633 หมู่ ขนาดประมาณ 70.3 กิโลดัลตัน และพบบริเวณจับเกาะของไรโบโซมและ inverted repeat เปรียบเทียบความเหมือนของโปรตีน SDX พบว่ามีความเหมือนกับเอนโดเดกซ์แทรนเนสของ Arthrobacter globiformis T-3044, เดกซ์แทรนเนสของ Arthrobacter sp. CB-8 และไอโซมอลโทไทรโอเดกซ์แทรนเนสของ Brevibacterium fuscum var. dextranlyticum 0407 83%, 82% และ 79% ตามลำดับ และได้โคลนชิ้นดีเอ็นเอ SUDEX3 เข้าสู่ พลาสมิด pSUDEX1 เพื่อเชื่อมต่อยีน sdx ให้สมบรูณ์