ภาวะที่เหมาะสมในการผลิตไคทิเนสจากแบคทีเรียเพื่อใช้ในการผลิตน้ำตาล เอ็น-แอซีทิล-ดี-กลูโคซามีน และเอ็น-แอซีทิลไคโทโอลิโกแซ็กคาไรด์

ธัญญลักษณ์ ศรีรังสิต

Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/14836

Title:	ภาวะที่เหมาะสมในการผลิตไคทิเนสจากแบคทีเรียเพื่อใช้ในการผลิตน้ำตาล เอ็น-แอซีทิล-ดี-กลูโคซามีน และเอ็น-แอซีทิลไคโทโอลิโกแซ็กคาไรด์
Other Titles:	Optimization of bacterial chitinase production for producing N-acetyl-D-glucosamine and N-acetyl chitooligosaccharide
Authors:	ธัญญลักษณ์ ศรีรังสิต
Advisors:	รัฐ พิชญางกูร
Other author:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
Advisor's Email:	rath.p@chula.ac.th
Subjects:	ไคติเนส การหมัก แบคทีเรีย
Issue Date:	2549
Publisher:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract:	งานวิจัยนี้ศึกษาปัจจัยที่มีผลต่อการเลี้ยงแบบ submerged ของการผลิตไคทิเนส โดยเชื้อโคลน Chi60 และ Aeromonas caviae D6 ในระดับขวดเขย่า (shaking-flask) และระดับถังหมัก (fermenter) การเลี้ยงในขวดเขย่า ของเชื้อโคลน Chi60 ซึ่งเป็นเชื้อที่ได้จากการโคลนยีนไคทิเนสจากเชื้อ Serratia sp. TU09 สามารถเจริญและผลิตไคทิเนสที่มีแอคติวิตีสูงสุดเมื่อเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ LB ที่ปริมาตรของอาหารเลี้ยงเชื้อต่อปริมาตรขวดเขย่า 40% และความเร็วในการเขย่าที่ 250 รอบต่อนาที และการเลี้ยงในถังหมักไคทิเนส Chi60 มีแอคติวิตีสูงสุด ในอาหารเลี้ยงเชื้อ LB 6 ลิตร ในถังหมักขนาด 15 ลิตร ที่ DO 2.5 % และเมื่อวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการย่อยของ ไคทิเนส Chi60 ด้วย HPLC พบว่า ผลิตภัณฑ์หลักที่ได้ คือ ไดเมอร์ โดยได้ผลิตภัณฑ์มากที่สุดเมื่อย่อยคอลลอยดอลไคทิน รองลงมา คือ ไคทินกุ้ง ไคทินแกนหมึก และเปลือกกุ้ง ตามลำดับ ส่วนการเลี้ยงในขวดเขย่าของเชื้อ Aeromonas caviae D6 ซึ่งเป็นเชื้อที่คัดแยกได้จากดินที่จังหวัดนครปฐมสามารถเจริญและผลิตไคทิเนส ที่มีแอคติวิตีสูงสุดเมื่อเลี้ยงในอาหาร MM ที่ใช้ไคทินกุ้งและเปลือกกุ้งที่ปั่นละเอียดเป็นแหล่งคาร์บอน พบว่า ใช้ 2.0% ไคทินกุ้งปั่นละเอียด และปริมาตรของอาหารเลี้ยงเชื้อต่อปริมาตรขวดเขย่าที่ 50% และใช้ 1.5% เปลือกกุ้งปั่นละเอียด และปริมาตรของอาหารเลี้ยงเชื้อต่อปริมาตรขวดเขย่าที่ 10% โดยไคทิเนสมีแอคติวิตีสูงสุดในอาหารทั้ง 2 ชนิด ที่ 0.25 % yeast extract นอกจากนี้ผลของแร่ธาตุต่างๆ ได้แก่ Fe, Mn, Zn, Ca, Cu มีผลต่อแอคติวิตีของไคทิเนสน้อยมาก ยกเว้น 0.01% Cu ไคทิเนสมีแอคติวิตีเพียงเล็กน้อย การหาภาวะที่เหมาะสมในการผลิตไคทิเนส ในระดับถังหมักของเชื้อ Aeromonas caviae D6 ในอาหารเลี้ยงเชื้อ MM ที่ใช้เปลือกกุ้งที่ปั่นละเอียดเป็นแหล่งคาร์บอน 3.5 ลิตร ในถังหมักขนาด 5 ลิตร มีแอคติวิตีสูงสุดที่ DO 20% ลักษณะสมบัติของไคทิเนสต่างๆ พบว่า ไคทิเนสที่ผลิตจาก A.caviae D6 ทำงานได้ดีในช่วง pH กว้าง ตั้งแต่ pH 5 -10 โดยทำงานได้ดีที่สุดใน Tris-HCl buffer pH 7 อุณหภูมิ 50 ํC และสามารถย่อย PNAC ได้ดีที่สุด รองลงมา คือ คอลลอยดอลไคทิน และเบทาไคทิน เมื่อแยกโปรตีนด้วย SDS-PAGE และย้อมแอคติวิตี พบว่า ไคทิเนสจาก A.caviae D6 ที่เลี้ยงด้วยไคทินกุ้งปั่นละเอียดมีแถบแอคติวิตี 1 แถบ ขนาดประมาณ 60 kDa และพบว่าเมื่อเลี้ยงด้วยเปลือกกุ้งปั่นละเอียดมีแถบแอคติวิตีอย่างน้อย 3 แถบ ขนาดประมาณ 60, 70 และ 90 kDa ตามลำดับ และจากการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการย่อยไคทินชนิดต่างๆ ของไคทิเนสจาก A.caviae D6 ด้วย HPLC พบว่า ผลิตภัณฑ์หลักที่ได้ คือ มอนอเมอร์ และได้ผลิตภัณฑ์มากที่สุดเมื่อย่อยคอลลอยดอลไคทิน รองลงมา คือ ไคทินแกนหมึก
Other Abstract:	The effects of submerged cultivation parameters on the production of chitinase Chi60 by E.coli and Aeromonas caviae D6 in shaking-flask and fermenter level were investigated. Chi60, cloned from Serratia sp. TU09, was expressed in E.coli. In the shaking-flask level, E.coli cells expressing Chi60 can grow and produce the optimal Chi60 activity when they are cultured in LB medium at 40% volume of medium per flask volume ratio, at 250 rpm. A 15 L fermentation level scale-up cultivation of E.coli expressing Chi60 was conducted. The highest chitinase activity was obtained when the dissolved oxygen concentration (DO) was set at 2.5%, at 37 ํC, while the pH was not controlled. N, N'-diacetyl chitobiose was the major product of Chi60. We discovered that colloidal chitin gave the highest yield followed by shrimp chitin, squid pen chitin and shrimp shell, respectively. Aeromonas caviae D6 isolated from soil in Nakhonpathom Province, Thailand, produce the highest chitinolytic activity when it was induced by flake shrimp chitin and flake shrimp shell. In the shaking-flask level, when flake shrimp chitin was used as carbon source the optimum cultivation condition was in minimum medium, MM, ( 0.25 % yeast extract, 0.1 % (NH [subscript 4])[subscript 2]SO[subscript 4], 0.03 % MgSO[subscript 4].7H[subscript 2]O, 0.6 % KH[subscript 2]PO[subscript 4], 1.0 % K[subscript 2]HPO[subscript 4]) containing 2 % flake shrimp chitin, 50 % volume of medium per flask volume ratio. When flake shrimp shell was used as carbon source, optimal activity was obtained when MM contains 1.5 % flake shrimp shell and 10 % volume of medium per flask volume ratio was used. Addition of Fe, Mn, Zn, Ca, or Cu did not have any further addition effect on the production chitinolytic enzymes. Scale-up cultivation with a 5 L fermenter was conducted. Highest chitinase activity was obtained when the DO was set at 20%, 37 ํC, while the pH was not controlled. The optimum pH and temperature of the chitinolytic enzymes produced by A. caviae D6 was 5 -10 and 50๐C, respectively. Substrate specificity of the enzyme was highest on PNAC (partially-N-acetylated chitin) followed by colloidal chitin and [beta]-chitin, respectively. SDS-PAGE analysis shows a single chitinolytic activity band when A. caviae D6 was induced by flake shrimp chitin. However, at least three chitinolytic activity bands were found when A. caviae D6 was induced by flake shrimp shell. N-acetyl-D-glucosamine was the major product, identified by HPLC.
Description:	วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2549
Degree Name:	วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
Degree Level:	ปริญญาโท
Degree Discipline:	เทคโนโลยีชีวภาพ
URI:	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/14836
URI:	http://doi.org/10.14457/CU.the.2006.1042
metadata.dc.identifier.DOI:	10.14457/CU.the.2006.1042
Type:	Thesis
Appears in Collections:	Sci - Theses

Files in This Item:

File	Description	Size	Format
Thanyaluk_Sr.pdf		2.98 MB	Adobe PDF	View/Open

Show full item record