การคัดแยกและลักษณะสมบัติของแบคที่เรียทนร้อนที่สร้างโปรติเอส

Abstract

จากตัวอย่างน้ำ 9 ตัวอย่างและตัวอย่างดิน 15 ตัวอย่างที่เก็บจากแหล่งที่มีอุณหภูมิสูง 14 แห่ง สามารถคัดแยกแบคทีเรียชอบร้อน 65 องศาเซลเซียส ได้ 42 ไอโซเลต เมื่อทดสอบการสร้างวงใสรอบโคโลนีบนอาหารแข็ง BY ที่มี skim milk 1% พบว่ามีเพียง 12 ไอโซเลต ที่ให้วงใสรอบโคโลนีที่มีความกว้างตั้งแต่ 2.5 มม. ขึ้นไป เลือกไอโซเลตที่มีโปรติเอสแอคติวิตีสูงสุดคือ RW 60-6 มาศึกษาลักษณะทางสรีรวิทยาและชีวเคมีโดยอาศัย Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology พบว่าน่าจะเป็น Bacillus stearothermophilus นำโปรติเอสจากเชื้อ RW60-6 มาทำให้บริสุทธิ์บางส่วนโดยใช้การตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต และผ่านคอลัมน์แลกเปลี่ยนประจุดีอีเออี ไบโอเจล-เอ พบว่าแยกโปรติเอสได้ 2 ชนิด คือ โปรติเอส U (โปรติเอสที่ไม่จับกับตัวกลาง) และ โปรติเอส B (โปรติเอสที่จับกับตัวกลาง) มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 13.16 เท่า และ 4.77 เท่าตามลำดับ และมีแอคติวิตีเหลืออยู่ 10.68% และ 8.28% ของ crude เอนไซม์ตามลำดับ เมื่อนำมาตรวจหาน้ำหนักโมเลกุลด้วยวิธี SDS-PAGE พบว่าเอนไซม์ทั้งสองประกอบด้วยโปรติเอสที่มีขนาดน้ำหนักโมเลกุลต่างกัน 2 ชนิด ดังนี้ โปรติเอส U ประกอบด้วยโปรติเอสขนาด 200,000 และ 33,000 ดาลตัน ส่วนโปรติเอส B ประกอบด้วยโปรติเอสขนาด 197,000 และ 35,000 ดาลตัน จากการศึกษาลักษณะสมบัติของโปรติเอสที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์บางส่วน พบว่า โปรติเอสทั้งสองคล้ายคืออุณหภูมิและค่าความเป็นกรดด่างที่เหมาะสมในการทำงานอยู่ที่ 65 องศาเซลเซียส และ 7.0 ตามลำดับ โปรติเอสทั้งสองมีความเสถียรต่ออุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที และเสถียรต่อค่าความเป็นกรดด่าง 7.0-8.5 เป็นเวลา 30 นาที นอกจากนี้โปรติเอสทั้งสองถูกยับยั้งได้ด้วย EDTA จึงจัดเป็น นิวทรัลเมทัลโลโปรติเอส