ผลของภาวะการเก็บรักษาโอโอไซต์สุกรต่อการสุก และการปฏิสนธินอกร่างกาย

Abstract

งานวิจัยนี้ มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาผลของอุณหภูมิที่มีต่อความสามารถในการเจริญของโอโอไซต์สุกรเพื่อปฏิสนธินอกร่างกายและความเป็นไปได้ในการแช่แข็ง โดยใช้โอโอไซต์ที่เจาะได้จากฟอลลิเคิลขนาด 2-6 มม. ของรังไข่สุกรจากโรงฆ่าสัตว์ และใช้มีเดียม M199B เป็นมีเดียมพื้นฐานในการเก็บและคัดเลือก โอโอไซต์ การเลี้ยงโอโอไซต์ให้สุก เลี้ยงใน IVM มีเดียม ซึ่งเป็นมีเดียม M199B ที่เสริม ฟอลลิเคิล สติมูเลติง ฮอร์โมน 1 หน่วย/มล. ลูทีไนซิง ฮอร์โมน 1 หน่วย/มล. เอสตราไดออล 1 ไมโครกรัม/มล. และของเหลวจากฟอลลิเคิล 10% โดยปริมาตร และได้นำไข่สุกมาได้ทำการปฏิสนธิกับน้ำเชื้อสดที่รีดจากพ่อสุกร ใน IVF มีเดียม ซึ่งเป็นมีเดียม M199B ที่เติม คาเฟอีน 2 มิลลิโมลาร์ ทั้งการเลี้ยงไข่ให้สุกและการปฏิสนธิกระทำในตู้บ่มอุณหภูมิ 39°ซ ในบรรยากาศที่มีคาร์บอนไดออกไซด์ 5% ในอากาศ จากการศึกษาการเจริญของโอโอไซต์ที่เลี้ยงนาน 12-48 ช.ม. โดยตรวจดูทุก ๆ 2 ช.ม. พบว่าโอโอไซต์เจริญถึงระยะเมตาเฟส II ประมาณชั่วโมงที่ 32 และเริ่มมีเปอร์เซ็นต์การสุกสูง (80.5%) ตั้งแต่ชั่วโมงที่ 36 เป็นต้นไป และจากการทดสอบการปฏิสนธิของน้ำเชื้อจากพ่อพันธุ์สุกร 7 ตัว พบว่า น้ำเชื้อจากพ่อพันธุ์สุกรแต่ละตัวให้ผลการปฏิสนธิและการเจริญถึง 2-4 เซลล์แตกต่างกัน เมื่อศึกษาเปรียบเทียบการเจริญของโอโอไซต์ที่ได้จากรังไข่ที่เก็บไว้ที่ 24°ซ ก่อนนำมาเลี้ยงเป็นเวลา 0 8 12 18 หรือ 24 ช.ม. หลังจากนำรังไข่มาถึงห้องปฏิบัติการ พบว่าสามารถเก็บรังไข่ไว้ได้นาน 8 ช.ม. โดยมีเปอร์เซนต์ไข่สุกที่แตกต่างอย่างไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (P > 0.05) กับโอโอไซต์ที่ได้จากการเจาะรังไข่ทันทีที่มาถึงห้องปฏิบัติการ ในการทดสอบความเป็นพิษของสารป้องกันการเกิดเกล็ดน้ำแข็งภายในเซลล์ 5 ชนิด ได้แก่ กลีเซอโรล (GLY) ไดเมทิลซิลฟอกไซด์ (DMSO) เอทิลีนไกลคอล (EG) โปรปีลีนไกลคอล (PROH) บิวเทนไดออล (BUOH) พบว่า สารทุกชนิดที่ 1.5 โมลาร์ ไม่เป็นอันตรายต่อโอโอไซต์ที่จะเจริญจนสุก การทดลองลดอุณหภูมิของโอโอไซต์ลงจาก 29°ซ ถึง 4°ซ จะพบว่า เมื่ออุณหภูมิลดลงถึง 15°ซ เปอร์เซ็นต์ไข่สุกจะลดลงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P < 0.001) และถ้าอุณหภูมิลดลงต่ำกว่า 15°ซ จนถึง 4°ซ จะไม่มีไข่สุกเลย ได้ทำการทดสอบความเป็นพิษของมีเดียม VTM 3 ชนิด สำหรับการทำไวตริฟิเคชัน คือ VTM 1 ประกอบด้วย EG 7.5 โมลาร์ ใน มีเดียม 199 ที่มี โบวายน์ซีรัมอัลบูมิน (BSA) 6% VTM 2 ประกอบด้วย EG 6.25 โมลาร์ และ GLY 0.7 โมลาร์ ซูโครส 0.1 โมลาร์ ในมีเดียม 199 ที่มี 20% ฟีตอลโบวายน์ซีรัม และ VTM 3 ประกอบด้วย EG 7.15 โมลาร์ ซูโครส 0.1 โมลาร์ และไซโตชลาซิน บี (CB) 1.75 ไมโครกรัม/มล. ในมีเดียม 199 ที่มี 20% ฟีตอลโบวายน์ซีรัม พบว่าการปรับสมดุลย์แรงดันออสโมติคในมีเดียม VTM ทุกชนิด ไม่มีผลทำให้โอโอไซต์สุกแตกต่างไปจากการเลี้ยงโอโอไซต์ให้สุกตามปกติอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ และเมื่อนำโอโอไซต์มาทำแช่แข็งด้วยวิธีไวตริฟิเคชัน พบว่าโอโอไซต์ที่ผ่านการแช่แข็งจากทุกมีเดียมไม่สามารถเจริญต่อหลังการละลาย เพราะเกิดการทำลายนิวเคลียสและโอโอเลมมา และการทดลองแช่แข็งไข่สุกพบว่าหลังการละลายไข่สุกไม่สามารถทำการปฏิสนธิได้และเกิดการทำลายนิวเคลียสและโอโอเลมมาด้วยเช่นกัน ซึ่งสามารถยืนยันได้จากภาพถ่ายจากกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอนแบบทรานสมิชชัน การศึกษาครั้งนี้ทำให้สามารถใช้ประโยชน์จากรังไข่สุกรซึ่งมีอยู่มากให้เป็นประโยชน์ต่อการศึกษาวิจัยหาความรู้เกี่ยวกับการเจริญและพัฒนาของเซลล์ไข่ตลอดจนฝึกฝนหาประสบการณ์ในงานปฏิสนธินอกร่างกาย