Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/42659
| Title: | การทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนจาก Bacillus subtilis N3 ที่มีฤทธิ์ต้านราก่อโรคพืช Bipolaris sp. |
| Other Titles: | PURIFICATION OF PROTEINS, FROM Bacillus subtilis N3, WITH ANTIFUNGAL ACTIVITY ON PHYTOPATHOGEN Bipolaris sp. |
| Authors: | สุดารัตน์ นุชวงษ์ |
| Advisors: | ปาหนัน เริงสำราญ |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์ |
| Advisor's Email: | panan.r@chula.ac.th |
| Subjects: | สารต้านเชื้อรา โรคเกิดจากเชื้อราในพืช ข้าวโพด Antifungal agents Fungal diseases of plants Corn |
| Issue Date: | 2556 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | แบคทีเรีย B. subtilis N3 ที่คัดแยกได้จากดินสามารถผลิตโปรตีนที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งรา Bipolaris sp. ที่ก่อโรคใบไหม้แผลเล็กในข้าวโพดได้ โดยวัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้คือการแยกและทำบริสุทธิ์โปรตีนที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งราก่อโรคพืชจากน้ำเลี้ยงเชื้อของแบคทีเรียที่เลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Tryptic soy broth ที่ pH 7.5 และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 18 ชั่วโมง ผลการทดลองพบว่าน้ำเลี้ยงเชื้อมีประสิทธิภาพในการยับยั้งราก่อโรคพืชได้ดี โดยมีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งประมาณ 65 เปอร์เซ็นต์ และมีค่าแอกทิวิตีจำเพาะเท่ากับ 79.08 AUต่อมิลลิกรัมของโปรตีน โปรตีนที่มีฤทธิ์ในการยับยั้งราก่อโรคพืชสามารถแยกและทำบริสุทธิ์ได้ โดยการตกตะกอนโปรตีนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตที่ช่วงความเข้มข้น 40-80% ของแอมโมเนียมซัลเฟต โดยมีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งเท่ากับ 80% และมีค่าแอกทิวิตีจำเพาะเท่ากับ 118.18 AUต่อมิลลิกรัมของโปรตีน จากนั้นทำบริสุทธิ์โปรตีนด้วยวิธีแอนไอออนเอกซ์เชนจ์ด้วยไดเอธิลอะมิโนเอธิล (DEAE Bio-gel A) โดยโปรตีนที่ผ่านการทำบริสุทธิ์ในช่วงลำดับส่วนที่ 45-50 (ตัวอย่างที่ 38) มีเปอร์เซ็นต์การยับยั้งเท่ากับ 62% และมีค่าแอกทิวิตีจำเพาะเท่ากับ 159.61 AUต่อมิลลิกรัมของโปรตีน เมื่อผ่านการทำโซเดียมโดเดซิลซัลเฟตพอลิอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรฟอเรซิสพบว่ามีแถบโปรตีนเพียงแถบเดียว ซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 34.61 kDa จากการวิเคราะห์ด้วยวิธี Liquid Chromatography Quadrupole Time-of-Flight Tandem Mass Spectrometry พบว่ามีลายพิมพ์เพปไทด์ใกล้เคียงกับโปรตีนแฟลกเจลลินที่ผลิตจาก Bacillus amyloliquefacien subsp. plantarum โดยมีคะแนนความเหมือนของลำดับเพปไทด์เท่ากับ 52% นอกจากนี้เมื่อศึกษาลักษณะของสายใยและสปอร์ราก่อโรคพืชภายใต้กล้องจุลทรรศน์พบว่าโปรตีนที่แยกและทำบริสุทธิ์ได้สามารถยับยั้งการเจริญและการงอกของสปอร์ราก่อโรคพืช โดยความเข้มข้นของโปรตีนที่สามารถยับยั้งการเจริญของราก่อโรคพืชได้ 50% (IC50) มีค่าเท่ากับ 0.045 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร นอกจากนี้โปรตีนที่แยกและทำบริสุทธิ์ได้สามารถป้องกันการรุกรานของรา Bipolaris sp. ที่ก่อโรคในใบข้าวโพดได้มากกว่า 89% ดังนั้นจากงานวิจัยนี้พบว่าโปรตีนที่แยกและทำบริสุทธิ์ได้จากแบคทีเรีย B. subtilis N3 สามารถนำไปประยุกต์ใช้ในการควบคุมปัญหาโรคใบไหม้แผลเล็กในข้าวโพดที่มีสาเหตุจากรา Bipolaris sp. ได้ |
| Other Abstract: | B. subtilis N3, a soil borne bacterium, showed antifungal activity against Bipolaris sp. which is a causal agent of Southern corn leaf blight. The objective of this research was to isolate and purify the antifungal proteins from the culture filtrate of B. subtilis N3 which was produced by culturing the bacterium in tryptic soy broth medium, pH 7.5 at 30°C for 18 hours. The result indicated that the culture filtrate demonstrated 65% inhibition on mycelial growth and accounted for 79.08 AU/mg of specific activity. The antifungal protein was fractionated in 40-80% ammonium sulfate saturation, with around 80% inhibition and 118.18 AU/mg of specific activity. This protein was further purified by anion exchange chromatography on diethylaminoethyl (DEAE Bio-gel A). The purified antifungal fraction from fraction numbers 45-50 (sample 38) exhibited the highest level of antifungal activity of about 62% and 159.61 AU/mg of specific activity. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis revealed a single band with a molecular weight corresponded to 34.61 kDa. Liquid Chromatography Quadrupole Time-of-Flight Tandem Mass Spectrometry gave peptide fingerprint with significant similarity to flagellin from Bacillus amyloliquefacien subsp. plantarum with sequence coverage of 52%. Moreover, morphological study under microscope showed that the mycelial growth and conidia germination were significantly inhibited by the purified antifungal protein. The 50% inhibitory concentration (IC50) of the antifungal activity toward Bipolaris sp. was 0.045 mg/ml. Furthermore, the purified antifungal protein was able to prevent as well as protect disease development caused by Bipolaris sp. on corn leaves. The results from current investigation provide the evidence that the protein from B. subtilis N3 is applicable for the control of Southern corn leaf blight disease caused by Bipolaris sp. |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2556 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | จุลชีววิทยาทางอุตสาหกรรม |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/42659 |
| URI: | http://doi.org/10.14457/CU.the.2013.134 |
| metadata.dc.identifier.DOI: | 10.14457/CU.the.2013.134 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Sci - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| 5472132823.pdf | 5.31 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.