Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/42664
Title: ANTAGONISTIC EFFECT AGAINST BEE PATHOGENS BY GUT BACTERIA IN CAVITY NESTING HONEYBEE Apis cerana
Other Titles: ผลต่อต้านเชื้อก่อโรคในผึ้งโดยแบคทีเรียในทางเดินอาหารของผึ้งโพรง Apis cerana
Authors: Pawornrat Nonthapa
Advisors: Chanpen Chanchao
Orawan Duangphakdee
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Advisor's Email: chanpen@sc.chula.ac.th
Orawan.d@hotmail.com
Subjects: Apis cerana
ผึ้งโพรง
Issue Date: 2013
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: In an apiary, honeybees have had problems with pests and diseases leading to economic loss in apiculture. For example, American foulbrood (AFB) disease was caused by Paenibacillus larvae. Nosema disease was caused by Nosema ceranae and N. apis. Sacbrood disease was caused by sacbrood bee virus (SBV) and chalkbrood disease was caused by Ascosphaera apis. In this research, infection of P. larvae, N. ceranae, N. apis, SBV, and A. apis were investigated in Apis cerana. Fifty colonies were collected from ten apiaries in Samut-songkhram and Chumphon provinces in the central and the south of Thailand, respectively. Total DNA was extracted from larvae, pupae, and adults and amplified by multiplex PCR. In each reaction, it comprised of two pairs of primers (16S rRNA of P. larvae and cytochrome b of A. cerana), three pairs of primers (16S rRNA of N. ceranae, of N. apis, and RpS5 of A. mellifera), two pairs of primers (pol of SBV and 28S rRNA of A. mellifera), and two pairs of primers (5.8S rRNA of A. apis and RpS5 of A. mellifera). The results showed that 80%, 94%, 96%, and 80% of samples were not infected by P. larvae, N. ceranae, N. apis, and A. apis, respectively. The phylogenetic lineage depending on the partial sequences of 16S rRNA of P. larvae, N. ceranae, N. apis, and 5.8S rRNA of A. apis exhibited six, two, single, and four distinct clusters, respectively. Bacteria in healthy bee’s gut such as Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp. were identified by fermentation test. Bacillus sp., Lactobacillus sp., and lactic acid bacteria were identified by the analyzed sequence of 16S rRNA. Then, the antagonistic effect of selected gut bacteria which were Bacillus sp., Pantoea sp., Azotobacter sp., Klebsiella sp., and Lactobacillus sp. against P. larvae, strain 01 and 02 was determined by agar well diffusion assay. It revealed that Azotobacter sp. showed the highest relative inhibitory zone effect on strain 02 with 56.68c±3.17% in diameter. The supernatant of targeted bacteria showing the antibacterial activities against strain 01 and 02 at 37 ºC were from Bacillus sp., Lactobacillus sp., Klebsiella sp., Azotobacter sp., and at 90 ºC were from Lactobacillus sp., Klebsiella sp., Azotobacter sp., and Bacillus sp. The supernatant treated at 121 ºC, with proteinase K and RNase A did not show the inhibitory effect. Furthermore, the supernatant from Pantoea sp. at pH 5, Bacillus sp. at pH 3, Klebsiella sp. at pH 3, Lactobacillus sp. at pH 8 and 10, and Klebsiella sp. at pH 10 showed the highest inhibitory effect against strain 01 and 02. The statistical analysis of mean difference was significant at the 0.05 level. The inhibitory activity of supernatant at pH 8-10 was reduced, comparing to supernatant at pH 5 which was the condition near the value of pH in bee stomach. Supernatant treated at 90 ºC showed the higher inhibitory effect against strain 01 and 02, comparing to supernatant at 37 ºC. In conclusion, gut bacteria which could inhibit P. larvae growth could be obtained from healthy bee.
Other Abstract: ในฟาร์มผึ้ง มักพบปัญหาเกี่ยวกับศัตรูและโรคในผึ้ง อันนำไปสู่การสูญเสียทางเศรษฐกิจในอุตสาหกรรมการเลี้ยงผึ้ง ยกตัวอย่างเช่น โรคตัวอ่อนเน่าอเมริกัน (AFB) ที่เกิดจากเชื้อ Paenibacillus larvae, โรคโนซีม่าเกิดจากเชื้อ Nosema ceranae และ N. apis, โรคแซคบรูด (SBV) เกิดจากเชื้อ sacbrood bee virus (SBV), และโรคชอล์คบรูดที่เกิดจากเชื้อ Ascosphaera apis ซึ่งในงานวิจัยนี้ได้ทำการสำรวจการติดเชื้อ P. larvae, N. ceranae, N. apis, และ A. apis ในผึ้งโพรง 50 รังที่เก็บจากฟาร์มเลี้ยงผึ้ง 10 แหล่งในจังหวัดสมุทรสงครามและชุมพร ซึ่งอยู่ทางภาคกลางและภาคใต้ของประเทศไทย ทำการสกัดดีเอ็นเอจากตัวหนอน ดักแด้และตัวเต็มวัยผึ้ง จากนั้นทำการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอโดยวิธี multiplex PCR ซึ่งในแต่ละปฏิกิริยาประกอบด้วยไพรเมอร์สองคู่ (16S rRNA ของ P. larvae และ cytochrome b ของ A. cerana), ไพรเมอร์สามคู่ (16S rRNA ของ N. ceranae, N. apis และ RpS5 ของ A. mellifera), ไพรเมอร์สองคู่ (pol ของ SBV และ 28S rRNA ของ A. mellifera), และไพรเมอร์สองคู่ (5.8S rRNA ของ A. apis และ RpS5 ของ A. mellifera) ผลการศึกษาพบตัวอย่างจำนวน 80%, 94%, 96%, และ 80% ไม่มีการติดเชื้อ P. larvae, N. ceranae, N. apis, และ A. apis ตามลำดับ เพื่อสร้างแผนภูมิทางสายวิวัฒนาการของ P. larvae, N. ceranae, N. apis, และ A. apis จากลำดับเบสบางส่วนของ 16S rRNA สามารถแยก cluster ได้จำนวน 6, 2, 1, และ 4 clusters ที่แตกต่างกัน ตามลำดับ นอกจากนี้ยังทำการจัดจำแนกแบคทีเรียจากลำไส้ของผึ้งที่มีสุขภาพดีโดยใช้วิธีทดสอบการหมักพบแบคทีเรียในสกุล Bifidobacterium และ Lactobacillus และผลจากการวิเคราะห์ลำดับเบสบางส่วนของ 16S rRNA สามารถจัดจำแนกแบคทีเรียในสกุล Bacillus, Lactobacillus, และ lactic acid bacteria จากนั้นนำแบคทีเรียที่จำแนกได้มายับยั้งเชื้อ P. larvae สายพันธุ์ 01 และ 02 โดยใช้วิธี agar well diffusion assay พบว่าแบคทีเรียในสกุล Bacillus, Pantoea, Azotobacter, Klebsiella, และ Lactobacillus มีผลต่อต้านเชื้อก่อโรคได้ดี และพบว่า Azotobacter มีผลต่อต้านสูงสุดต่อสายพันธุ์ 02 มีความสัมพันธ์ของเส้นผ่านศูนย์กลางการยับยั้งที่ 56.68c±3.17% นอกจากนี้ได้นำส่วนใสจากการปั่นเหวี่ยงตะกอนออกของ Bacillus, Lactobacillus, Klebsiella, Azotobacter หลังบ่มที่อุณหภูมิ 37 ºC และส่วนใสของ Lactobacillus, Klebsiella, Azotobacter, Bacillus หลังบ่มที่อุณหภูมิ 90 ºC มาทำการทดสอบ พบผลต่อต้านสายพันธุ์ 01 และ 02 แต่ไม่พบผลต่อต้านเชื้อเมื่อบ่มส่วนใสที่ 121 ºC, และบ่มร่วมกับ proteinase K และ RNase A นอกจากนี้เมื่อปรับส่วนใสของเชื้อ Pantoea ให้มีค่า pH 5, Bacillus ให้มีค่า pH 3, Klebsiella ให้มีค่า pH 3, Lactobacillus ให้มีค่า pH 8 และ 10, และ Klebsiella ให้มีค่า pH 10 พบว่าให้ผลต่อต้านสายพันธุ์ 01 และ 02 สูงสุดจากการวิเคราะห์ความแตกต่างของค่าเฉลี่ยอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ระดับความเชื่อมั่น 95 เปอร์เซ็นต์ ผลต่อต้านจากส่วนใสที่ภาวะ pH 8-10 มีฤทธิ์ลดลงเมื่อเปรียบเทียบกับส่วนใสที่ภาวะ pH 5 ซึ่งมีค่า pH ใกล้เคียงกับภาวะกรดอ่อน ๆ ในท้องผึ้ง และส่วนใสที่อุณหภูมิ 90 ºC มีผลต่อต้านสายพันธุ์ 01 และ 02 สูงกว่าส่วนใสที่อุณหภูมิ 37 ºC จึงสามารถสรุปได้ว่าพบแบคทีเรียในทางเดินอาหารที่สามารถต่อต้านการเติบโตของเชื้อ P. larvae ได้
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2013
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Biotechnology
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/42664
URI: http://doi.org/10.14457/CU.the.2013.140
metadata.dc.identifier.DOI: 10.14457/CU.the.2013.140
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5472190123.pdf2.52 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.