Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/43846
Title: STRUCTURE AND FUNCTION ANALYSIS OF crustinPm1 AND crustinPm7 FROM BLACK TIGER SHRIMP Penaeus monodon
Other Titles: การวิเคราะห์โครงสร้างและหน้าที่ของ crustinPm1 และ crustinPm7 จากกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon
Authors: Sopacha Arayamethakorn
Advisors: Anchalee Tassanakajon
Kuakarun Krosong
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Advisor's Email: Anchalee.K@chula.ac.th
kuakarun.k@chula.ac.th
Subjects: Penaeus monodon
Peptide antibiotics
กุ้งกุลาดำ
เปปไทด์ต้านจุลชีพ
สารต้านจุลชีพ
Issue Date: 2013
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Antimicrobial peptides (AMPs) are considered to play an important role in humoral defense against pathogen infection. CrustinPm1 and crustinPm7 are two of most abundant crustin identified from the hemocytes of the black tiger shrimp, Penaeus monodon. This research aims to study (1) activities and binding properties of the recombinant crustinPm1 (rcrustinPm1) and recombinant crustinPm7 (rcrustinPm7), (2) the secondary structure of both crustins, (3) crystallization of the rcrustinPm1, and (4) the regulation of crustinPm1 and crustinPm7 gene expressions. In this study, crustinPm1 and crustinPm7 were overexpressed in Pichia pastoris. Antimicrobial assays demonstrated that rcrustinPm1 was active against Gram-positive bacteria only but rcrustinPm7 inhibited both Gram-positive and Gram-negative bacteria. The rcrustinPm1 and rcrustinPm7 showed no proteinase inhibitory activity against the commercial proteinases and proteinase from Bacillus subtilis. Study of lipid-protein interaction showed that both crustins could specifically bind phosphatidic acid (PA). Enzyme-linked immunosorbent assay suggested that crustins bind to PA with positive cooperativity of Hill slope (H) > 2. This indicates that at least two molecules of crustins interact with one PA molecule. In addition, circular dichroism spectroscopy was used to determine secondary structure of crustinPms. CrustinPm1 contained 40.81% of alpha-helix and 22.34% of beta-sheet, whereas crustinPm7 contained 32.86% of alpha-helix and 27.53% of beta-sheet. Crystallization of rcrustinPm1 was performed and crystals were obtained in some crystallization conditions. However, these crystals gave no diffraction. Therefore, crystallization conditions will be optimized for further crystal growth. Regulatory pathways of crustinPm1 and crustinPm7 were investigated by PmRelish and PmMyD88 knockdown. It is likely that crustinPm1 was mediated through Toll signaling pathway, while crustinPm7 was related with both Toll and Imd pathways.
Other Abstract: เปปไทด์ต้านจุลชีพมีบทบาทสำคัญในระบบภูมิคุ้มกันโดยสารน้ำ ซึ่งมีฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลชีพ ครัสตินไอโซฟอร์ม 1 (crustinPm1) และครัสตินไอโซฟอร์ม 7 (crustinPm7) เป็นสองไอโซฟอร์มซึ่งพบมากในเม็ดเลือดของกุ้งกุลาดำ งานวิจัยนี้สนใจศึกษา (1) ฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของแบคทีเรีย และสมบัติการจับของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 และ crustinPm7 (2) โครงสร้างทุติยภูมิของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ครัสตินทั้งสองไอโซฟอร์ม (3) การตกผลึกของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 และ (4) การควบคุมการแสดงออกของยีน crustinPm1 และ crustinPm7 จากการศึกษาโปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 และ crustinPm7 มีการแสดงออกอย่างมากในยีสต์ Pichia pastoris และเมื่อทดสอบฤทธิ์การยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย พบว่า crustinPm1 มีฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรียแกรมบวกเท่านั้น ในขณะที่ crustinPm7 สามารถยับยั้งได้ทั้งแบคทีเรียแกรมบวก และแบคทีเรียแกรมลบ อีกทั้งศึกษาฤทธิ์การยับยั้งการทำงานของเอนไซม์โปรติเนส พบว่า โปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 และ crustinPm7 ไม่มีแอคทิวิตีในการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์โปรติเนสทางการค้า และเอนไซม์โปรติเนส จาก Bacillus subtilis จากการศึกษาการจับกันระหว่างลิพิดและโปรตีน แสดงให้เห็นว่า ครัสตินทั้งสองไอโซฟอร์มสามารถจับได้อย่างจำเพาะกับกรดฟอสฟาทิดิก (Phosphatidic acid, PA) และจากผลของ Enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay พบว่า ครัสตินทั้งสองไอโซฟอร์มสามารถจับกับกรดฟอสฟาทิดิก แบบ Positive cooperative โดยมีค่า Hill slope (H) มากกว่า 2 ชี้ให้เห็นว่า ครัสตินอย่างน้อย 2 โมเลกุล สามารถจับกับกรดฟอสฟาทิดิก 1 โมเลกุล จากการศึกษาโครงสร้างทุติยภูมิของครัสตินทั้งสองไอโซฟอร์มโดยวิธีเซอร์คิวลาร์ไดโครอิซึม (Circular Dichroism Spectroscopy) แสดงให้เห็นว่า โปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 มีองค์ประกอบของ alpha-helix 40.81% และ beta-sheet 22.34% ส่วนโปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm7 มีองค์ประกอบของ alpha-helix 32.86% และ beta-sheet 27.53% จากการทดลองตกผลึกโปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 พบว่า ได้ผลึกของโปรตีนในหลายสภาวะ อย่างไรก็ตาม พบว่าผลึกที่ได้นั้นไม่ให้การเลี้ยวเบนของรังสีเอ็กซ์ จึงต้องปรับปรุงสภาวะเพื่อให้เหมาะสมสำหรับการเติบโตของผลึก นอกจากนี้ ได้ทำการทดลองลดการแสดงออกของ PmRelish และ PmMyD88 ถูกทำให้ไม่มีการแสดงออก เพื่อศึกษาวิถีการควบคุมการแสดงออกของ crustinPm1 และ crustinPm7 ซึ่งพบว่า crustinPm1 ถูกควบคุมผ่านวิถี Toll ในขณะที่ crustinPm7 ถูกควบคุมผ่านทั้งวิถี Toll และ Imd
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2013
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Biotechnology
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/43846
URI: http://doi.org/10.14457/CU.the.2013.1303
metadata.dc.identifier.DOI: 10.14457/CU.the.2013.1303
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5472260423.pdf3.81 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.