การเพิ่มประสิทธิภาพของการสังเคราะห์เพนนิซิลิน เอซิเลส ใน โปรเตียส เรทเกอไร

Abstract

เพนนิซิลิน เอซิเลส (E.C. 3.5.1.11) เป็นเอนไซม์เร่งปฎิกิรยาการไฮโดรไลซ์ เพนนิซิลิน จี ให้กรด 6-อะมิโนเพนนิซิลานิก ซึ่งนิยมใช้เป็นสารต้นตอในการกระบวนการสังเคราะห์อนุพันธ์ เพนนิซิลิน จุดประสงค์ของการวิจัยนี้เพื่อศึกษาธรรมชาติของแหล่งต้นตอคาร์บอนที่เหมาะสมต่อการผลิต เอนไชม์เพนนิซิลน เอซิเลส ใน P. rettgeri ATCC 9250 ตลอดจนเปรียบเทียบคุณสมบัติ เอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส P. rettgeri ATCC 9250 WT และมิวแทนท์ SPS-6 ซึ่งสามารถเจริญในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีกลูโคสเป็นสารต้นตอคาร์บอนเดี่ยวได้ เมื่อเจริญ P. rettgeri ATCC 9250 ที่อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส ในอาหารสูตรปรับต่ำที่เสริมด้วย แอสปาร์เตท 0.8 เปอร์เซ็นต์ ให้ค่าการเจริญ (OD 540) สูงสุด 4.5 หน่วย แอคติวิตี สูงสุดของเอนไซม์ เพนนิซิลิน ประมาณ 173 หน่วย ต่อ มิลลิกรัมโปรตีนรวมของเซลล์ สารต้นตอคาร์บอนคู่ที่เหมาะสมต่อการเจริญและผลิตเอนไชน์คือ ซิเตรต 0.2% ร่วมกับ กลูโคส 1.0% ให้ค่าการเจริญ และผลิตเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส สูงสุด 3.6 หน่วย และ 98 หน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีนรวมของเซลล์ ตามลำดับ P. rettgeri สายพันธุ์นี้ไม่สามารถใช้กลูโคสเป็นสารต้นตอคาร์บอนเดี่ยว ดังนั้นจึงเป็นที่น่าสนใจที่จะแยกมิวแทนท์ ซึ่งสามารถใช้กลูโคสเป็นแหล่งต้นตอของคาร์บอนได้ การกลายพันธุ์ P. rettgeri ATCC 9250 ด้วย NTG สามารถแยกมิวแทนท์ซึ่งใช้กลูโคสเป็นสารต้นตอของคาร์บอนเดี่ยวได้ 9 ตัว มิวแทนท์ SPS-6 สามารถเจริญและผลิตเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส ได้สูงในอาหารสูตรปรับต่ำที่เสริมด้วยกลูโคส 0.4% ค่าแอคติวิตีสูงสุดของเอนไชม์ ประมาณ 397 หน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีนรวมของเซลล์ และค่าการเจริญสูงสุด 4.6 หน่วย เมื่อทำการศึกษาเปรียบเทียบคุณสมบัติของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส ของสายพันธ์ P. rettgeri ATCC 9250 WT กับ มิวแทนท์ SPS-6 พบว่า พี เอช ที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยา การไฮโดรไลซ์ เพนนิซิลิน จี ของเอนไซม์ เพนนิซิลิน เอซิเลส เซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และ มิวแทนท์ SPS-6 มีค่าอยู่ในช่วงใกล้เคียงกันประมาณ 7.0-8. 5 อย่างไรก็ตาม ค่าอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเร่งปฎิกิริยาของเอนไซม์จากสายพันธุ์ทั้ง 2 จะแตกต่างกัน อุณหภูมิที่เหมาะสมในการทำงานของเอนไซม์มีค่า 450 ซ. สำหรับเซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และ 55o ซ. สำหรับเซลล์มิวแทนท์ SPS-6 เอนไซม์ เพนนิซิลน เอซิเลส ของเซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และ มิวแทนท์ SPS-6 มีความทนทานต่อสภาวะที่เป็นกรดและด่างมากได้ต่ำ สามารถเก็บเอนไซม์ไว้ที่ 370 ซ. นาน 5 ชั่วโมง โดยไม่มีการสูญเสียแอคติวิตี ค่า Km ต่อเพนนิซิลิน จี ของ เอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส ในเซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และมิวแทนท์ SPS-6 มีค่า 9.0 และ 5.6 มิลลิโมลาร์ กรดฟีนิลอะซีติก สามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์แบบแข่งขัน (Competitive inhibition) ให้ค่า Ki สำหรับเซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และมิวแทนท์ SPS-6 เท่ากับ 5.0 และ 7.0 มิลลิโมลาร์ ตามลำดับ การยังยั้งการทำงนของเอนไชม์ด้วนกรด 6ลอะมิโนเพนนิซิลานิก เป็นแบบไม่แข่งขัน (non-competitive inhibition) มีค่า Ki 7.6 มิลลิโมลาร์ สำหรับเซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และ 8.8 มิลลิโมลาร์ สำหรับเซลล์ มิวแทนท์ SPS-6 สายพันธุ์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และ มิวแทนท์ SPS-6 สามารถเก็บรักษาไว้ในสารละลายนอร์มอลซาลีน ที่อุณหภูมิ 40 ซ. ได้นาม 45 วัน พบว่า แอคติวิตีของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส จะยังคงเหลืออยู่ถึง 80 เปอร์เซ็นต์ ของ แอตติวิตีเริ่มต้น ยิ่งไปว่านั้นที่สภาวะเดียวกันนี้ มิวแทนท์ SPS-6 สามารถดำรงคุณสมบัติของการเจริญและผลิตเอนไชม์เพนนิซิลน เอซิเลส ได้สูง นานมากกว่า 7 เดือน