การแสดงออกของรีคอมบิแนนท์โปรตีน VP1 และ VP2 จากไวรัสก่อโรคโลหิตจางในไก่ใน Escherichia coli และการผลิตแอนติบอดี

Abstract

โรคโลหิตจางในไก่เป็นโรคที่ทำให้ไก่เกิดภาวะโลหิตจางชนิดรุนแรงและส่งผลให้การทำงานของระบบภูมิคุ้มกันลดต่ำลงซึ่งสาเหตุสำคัญเกิดจากการติดเชื้อไวรัสก่อโรคโลหิตจางในไก่ (Chicken Anemia Virus, CAV) โปรตีน VP1 ซึ่งเป็นโปรตีนหลักของเชื้อไวรัส CAV ด้วยคุณสมบัติในการเป็นแอนติเจนที่สูงสามารถถูกจดจำได้ดีจึงถูกนำไปใช้พัฒนาเป็นวัคซีนและชุดตรวจวินิจฉัยโรค จากการที่โปรตีน VP1 มีส่วนเป็นพิษต่อ Escherichia coli ซึ่งเป็นเซลล์เจ้าบ้าน จำนวน 60 กรดอะมิโน ที่ปลาย N-terminal จึงเป็นข้อจำกัดทำให้ผลิตโปรตีน VP1 ได้ในปริมาณน้อย นอกจากนี้ยังมีโปรตีน VP2 ซึ่งเป็นโปรตีนไม่ใช่โปรตีนโครงสร้างมีบทบาทสำคัญในการช่วยในการม้วนพับของโปรตีน VP1 ทำให้เกิดโครงสร้างอิพิโทปของไวรัสที่เหมาะสม จุดประสงค์ในงานวิจัยนี้เพื่อผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีน VP1 และ VP2 และการผลิตแอนติบอดีในหนูไมซ์ ด้วยการตัดส่วนเป็นพิษต่อเซลล์เจ้าบ้านออก จำนวน 60 กรดอะมิโน ที่ปลาย N-terminal (Δ60N_VP1) แล้วเชื่อมต่อกับดีเอ็นเอ VP2 จึงได้รูปแบบของดีเอ็นเอต่างๆ ดังนี้ Δ60N_VP1, VP2, VP2/Δ60N_VP1 และ Δ60N_VP1/VP2 ดีเอ็นเอทั้ง 4 รูปแบบได้ถูกโคลนเข้าสู่เวคเตอร์ pET28a(+) และชักนำเกิดการแสดงออกใน E.coli สายพันธุ์ Roseta-gami โดยใช้ IPTG ความเข้มข้น 0.2-0.3 มิลลิโมลาร์ ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 ชั่วโมง รีคอมบิแนนท์โปรตีนทั้งหมดได้ถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี affinity chromatography ซึ่งขนาดโปรตีนของ Δ60N_VP, VP2, VP2/Δ60N_VP1 และ Δ60N_VP1/VP2 ดังนี้คือ 45, 28, 73 และ 85 กิโลดาลตัน ตามลำดับ ด้วยคุณสมบัติในการเป็นแอนติเจนที่ดีของโปรตีน Δ60N_VP1 จึงได้นำมาใช้สำหรับตรวจหาแอนติบอดีต่อเชื้อไวรัส CAV จากซีรั่มไก่ จำนวน 152 ตัวอย่างด้วยวิธี indirect ELISA โดยพบให้ความไว ความจำเพาะ และความแม่นยำ เท่ากับ 87.50%, 95.31% และ 90.79% ตามลำดับ นอกจากนี้ยังพบว่าภายหลังการนำโปรตีน Δ60N_VP1 ไปฉีดกระตุ้นในหนูไมซ์ พบว่าหนูไมซ์มีการตอบสนองและผลิตพอลิโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อโปรตีน Δ60N_VP1 ได้ ดังนั้นโปรตีน Δ60N_VP1 จึงเป็นแอนติเจนที่เหมาะสมสำหรับนำไปใช้พัฒนาวัคซีนและแอนติบอดีต่อโปรตีน Δ60N_VP1 ยังสามารถนำไปประยุกต์ใช้ตรวจหาเชื้อไวรัส CAV ได้ต่อไป