Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/56301
| Title: | Characterization of the House Dust Mite Allergen, Der p 23 produced in Pichia pastoris. |
| Other Titles: | ลักษณะของสารก่อภูมิแพ้จากไรฝุ่น Der p 23 ที่ผลิตจากยีสต์ Pichia pastoris |
| Authors: | Wai Tuck Soh |
| Advisors: | Kiat Ruxrungtham Alain Jacquet |
| Other author: | Chulalongkorn University. Faculty of Medicine |
| Advisor's Email: | Kiat.R@Chula.ac.th,alain.j@chula.ac.th Alain.J@Chula.ac.th |
| Issue Date: | 2014 |
| Publisher: | Chulalongkorn University |
| Abstract: | Recent identified Der p 23 has been recognized as an important house dust mite (HDM) allergen which displays high IgE reactivity comparable to the major HDM allergens Der p 1 and Der p 2. Due to limited amounts of the natural allergen, the in-depth characterization of Der p 23 requires the production of a recombinant form. Present study aims were to produce a recombinant form of Der p 23 using P. pastoris expression system subsequently characterize its physicochemical properties and to analyze for the first time the IgE binding frequency of Der p 23 in a cohort of Thai HDM allergic patients as well as to evaluate the ability to activate innate immunity. The expression of secreted mature rDer p 23 reaches maximum at 48 hrs under 2% methanol induction and resulted in N-terminal truncation with longer induction period. rDer p 23 is characterize as a mannosylated protein (possibly modified at amino acid T30-T32) with two intra-disulfide bonds and adopt mainly unfolded structure. Polyclonal antibodies to rDer p 23 can detect the natural allergen in aqueous fecal pellets extracts suggesting that both forms of Der p 23 share common B-cell epitopes. rDer p 23 as well as the natural corresponding allergen were unable to interact in-vitro with chitin matrices. More than fifty percent of Thai HDM allergic patients (n=222) developed Der p 23-specific IgE which was comparable with the IgE binding frequency of rDer p 2 (67%). Meanwhile, the allergenicity of rDer p 23 was highlighted through degranulation of RBL cells expressing human FcεRI. Nevertheless, human airway epithelial cells were able to produce IL-8 in response to rDer p 23 (5-20µg/ml) through NF-κB and MAPK (MEK, JNK, and p38)-dependent activation signaling pathways. Our findings highlighted important levels of Der p 23 sensitizations in Thailand. The protease sensitivity of Der p 23 as well as the very limited release of this allergen from extracted mite fecal pellets clearly suggested that rDer p 23 may be a valuable material to replace standardized HDM extracts for the diagnosis of Der p 23 sensitivities. |
| Other Abstract: | ในปัจจุบันสารก่อภูมิแพ้ไรฝุ่นชนิดที่ 23 เป็นที่รู้จักในนามสารก่อภูมิแพ้ไรฝุ่นที่มีบทบาทในการกระตุ้นการแสดงออกของระดับ IgE ที่สูงมากเมื่อเทียบกับสารก่อภูมิแพ้หลักชนิดที่ 1 และ 2 ในไรฝุ่น การศึกษาลักษณะของสารก่อภูมิแพ้ไรฝุ่นชนิดที่ 23 อย่างละเอียดนี้ มีความจำเป็นต้องผลิตออกมาในรูปแบบของรีคอมบิแน้นท์โปรตีน เนื่องจากปริมาณอันจำกัดของสารก่อภูมิแพ้ในธรรมชาติที่ถูกสกัดโดยใช้บัฟเฟอร์ไม่เพียงพอ ในงานวิจัยครั้งนี้มีจุดประสงค์เพื่อผลิตรีคอมบิแน้นท์โปรตีนชนิดที่ 23 โดยกระบวนการแสดงออกของโปรตีนในยีสต์ P. pastoris, เพื่อศึกษาคุณลักษณะเชิงกายภาพพร้อมทั้งคุณลักษณะเชิงกล และวิเคราะห์ปฏิกิริยาความไวต่อการแพ้สารก่อภูมิแพ้ไรฝุ่นชนิดนี้ในกลุ่มตัวอย่างผู้ป่วยไทยเป็นครั้งแรก จึงนำไปสู่การตรวจสอบการกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันที่ติดตัวมาแต่กำเนิด (innate immunity) รีคอมบิแน้นท์โปรตีนที่สมบรูณ์ชนิดที่ 23 นี้สามารถผลิตออกมาได้ในรูปของโปรตีนที่ถูกหลั่งออกมาและละลายน้ำได้ การแสดงออกของโปรตีนที่สูงสุดจะเกิดในระยะ 48 ชั่วโมง ภายใต้การกระตุ้นโดยใช้ 2% ของปริมาณเมทานอล และส่งผลให้เกิดปรากฏการณ์ N-terminal truncation หากกระตุ้นในระยะเวลาที่มากขึ้น รีคอมบิแน้นท์โปรตีนชนิดที่ 23 ได้จัดอยู่ในกลุ่ม mannosylated protein ซึ่งอาจมีการเปลี่ยนแปลงของบริเวณกรดอะมิโน T30-T32 โดยพันธะภายในของกลุ่มไดซัลไฟด์ 2 พันธะนี้ ส่งผลให้โครงสร้างของโปรตีนส่วนใหญ่ไม่มีการม้วนพับ ดังที่แสดงผลใน เทคนิคในการวิเคราะห์ผลการวัดสัดส่วนมวลต่อประจุ (Mass spectrometry) และการศึกษาโครงสร้างทุติยภูมิ (Circular dichorism) โพลีโคนอลแอนตี้บอดีต่อรีคอมบิแน้นท์โปรตีนชนิดที่ 23 สามารถตรวจจับสารก่อภูมิแพ้ธรรมชาติชนิดที่ 23 ได้ในสารสกัดจาก fecal pellets สนับสนุนว่ามีโครงสร้าง B-cell epitopes ที่คล้ายกัน ถึงแม้รีคอมบิแน้นท์โปรตีนชนิดที่ 23 และสารก่อภูมิแพ้ไรฝุ่นชนิดที่ 23 ในธรรมชาตินี้จะคล้ายคลึงกับโปรตีนที่มีสมบัติในการจับกับไคติน แต่ก็ยังไม่สามารถจับกับเม็ดบีทไคตินสังเคราะห์ได้ จากนั้นพบว่า มากกว่าร้อยละ 50 ในกลุ่มผู้ป่วยไทยที่แพ้ไรฝุ่น (n=222) จะมีอาการแพ้จำเพาะต่อสารก่อภูมิแพ้ไรฝุ่นชนิดที่ 23 เมื่อเทียบกับอัตราการแพ้ต่อสารก่อภูมิแพ้ไรฝุ่นหลักชนิดที่ 2 (ร้อยละ 67) ในขณะที่เกิดการแพ้ของสารก่อภูมิแพ้ไรฝุ่นชนิดที่ 23 พบว่ามีการทำงานของกระบวนการดีแกรนูเลชั่นของเซลล์ RBL ที่มีการแสดงออกของ human FcεRI ร่วมกับ IgE จำเพาะต่อสารก่อภูมิแพ้ธรรมชาติชนิดที่ 23 ทันที อย่างไรก็ตามเซลล์ทางเดินหายใจในมนุษย์ยังสร้างไซโตไคน์ IL-8 เป็นการตอบสนองต่อรีคอมบิแน้นท์โปรตีนชนิดที่ 23 (5-20µg/ml) ผ่านทางกระบวนการส่งสัญญาณโดยตรงต่อ NF-κB และ MAPK (MEK, JNK, and p38) การวิจัยครั้งนี้เน้นระดับความสำคัญของการไวต่อการแพ้สารก่อภูมิแพ้ธรรมชาติกลุ่มที่ 23 ในประเทศไทย การไวต่อโปรติเอสของสารก่อภูมิแพ้ธรรมชาติชนิดที่ 23 กับปริมาณการหลั่งที่จำกัดจากสารก่อภูมิแพ้นี้จาก fecal pellets สนับสนุนว่ารีคอมบิแน้นท์โปรตีนชนิดที่ 23 อาจเป็นสารสำคัญที่มาแทนที่มาตาฐานของสารสกัดไรฝุ่นที่ใช้ในการวินิจฉัยอาการไวต่อการแพ้สารก่อภูมิแพ้ธรรมชาติชนิดที่ 23 ในธรรมชาติได้. |
| Description: | Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2014 |
| Degree Name: | Master of Science |
| Degree Level: | Master's Degree |
| Degree Discipline: | Medical Science |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/56301 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Med - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| 5674663230.pdf | 4.07 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.