Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59455
Title: BIOACTIVE PEPTIDE DERIVED FROM TRYPSIN HYDROLYSIS OF UNICELLULAR CYANOBACTERIUM Synechococcus sp.
Other Titles: เพปไทด์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพที่ได้จากทริปซินไฮโดรไลซิสของไซยาโนแบคทีเรียชนิดเซลล์เดี่ยว Synechococcus sp.
Authors: Rutairat Suttisuwan
Advisors: Aphichart Karnchanatat
Nuttha Thongchul
Saranya Phunpruch
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Advisor's Email: Aphichart.K@Chula.ac.th,i_am_top@hotmail.com,i_am_top@hotmail.com
Nuttha.T@Chula.ac.th
kpsarany@kmitl.ac.th
Issue Date: 2017
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: A free radicals can promote denaturing reactions in many cellular components, which create oxidative stress and it results to damage in body tissue. The free radicals can causing many diseases including heart diseases, Alzheimer, inflammation and cancer. This research aimed to investigate the effect of bioactive peptides derived from Synechococcus sp. cultured for 21 days on antioxidant, anti-inflammation and anticancer activities. The Synechococcus sp. protein hydrolysate was prepared by trypsin digest and purified by ultrafiltration with molecular weight cut off membranes of 10, 5 and 3 kDa. The MW <3 kDa fraction showed the highest NO, ABTS and DPPH radical scavenging activities with IC50 values of 34.51±9.8 µg protein/mL, IC50 11.54±0.3 µg protein/mL and IC50 13.63±0.15 µg protein/mL, respectively. The F2 fraction from gel filtration chromatography showed the strongest NO and ABTS radical scavenging activities with IC50 values of 7.68±0.64 µg protein/mL and 9.74±0.2 µg protein/mL, respectively. The F2 was purified by RP-HPLC to yield four fractions. The 30 – 40 min sub-fraction (F2-4) was selected for further analysis by mass spectroscopy. Five isolated peptides with amino acid sequences of AILQSYSAGKTK; 1,265.69 Da, ALNKTHLIQTK; 1,265.74 Da, LLVHAPVK; 875.55 Da, IPDAHPVK; 875.48 Da and VVVLRDGAVQQLGTPR; 1,706.97 Da were identified. The F2-4 had higher DPPH and NO radical scavenging activity compared to the synthetic peptide. Moreover, AILQSYSAGKTK had the highest ABTS radical scavenging activity. Furthermore, the F2 fraction protected oxidation-induced DNA damage in pBR322, pKS and pUC19 cells. F2 fraction was selected to study anti-inflammatory and anticancer properties. Anti-inflammatory effect, F2 fraction showed no cytotoxicity toward RAW264.7 macrophage cells. RT-PCR and qRT-PCR results showed that F2 reduced gene expression of pro-inflammatory cytokines iNOS, TNF-α, COX-1, COX-2 and IL-6. For anticancer activity, F2 fraction showed high anticancer activities in the human colon cancer cells (SW620) according to cytotoxic activity (MTT assay), with IC50 values of 106.58±21.46 µg protein/mL. The F2 fraction activated the apoptotic pathway in SW620 cells after treatment for 24, 48 and 72 hours. The highest activities of caspases 3, 8 and 9 were observed after treatment for 72 hours. These findings suggested that unicellular cyanobacterium Synechococcus sp. may be used to develop for natural anti-inflammation and natural anticancer drugs.
Other Abstract: อนุมูลอิสระสามารถทำให้เกิดปฏิกิริยาการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโมเลกุลในองค์ประกอบต่างๆของเซลล์ซึ่งทำให้เกิดภาวะเครียดที่เกิดจากการออกซิเดชันและส่งผลให้มีความเสียหายในเนื้อเยื่อของร่างกาย อนุมูลอิสระสามารถทำให้เกิดโรคต่างๆได้ เช่น โรคหัวใจ โรคสมองเสื่อม การอักเสบ และโรคมะเร็ง งานวิจัยนี้มีจุดประสงค์เพื่อทำการตรวจสอบผลของเพปไทด์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพที่ได้จาก Synechococcus sp. ที่มีอายุ 21 วัน ต่อกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระ การต้านการอักเสบ และการต้านมะเร็ง โดยโปรตีนไฮโดรไลเสทจาก Synechococcus sp. จากการย่อยโดยเอนไซม์ทริปซิน และนำไปทำให้บริสุทธิ์โดยใช้เทคนิคอัลตราฟิลเตรชันด้วยเมมเบรนที่มีขนาดโมเลกุล 10 5 และ 3 กิโลดาลตัน เพปไทด์ที่มีขนาดโมเลกุลน้อยกว่า 3 กิโลดาลตันแสดงค่า NO ABTS และ DPPH radical scavenging activities ได้สูงที่สุด โดยแสดงค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถกำจัดอนุมูลอิสระได้ร้อยละ 50 (IC50) เท่ากับ 34.51±9.8, 11.54±0.3 และ 13.63±0.15 ไมโครกรัมโปรตีนต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ จากนั้นนำเพปไทด์ที่มีขนาดโมเลกุลน้อยกว่า 3 กิโลดาลตัน มาทำให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิคเจลฟิวเตรชัน พบว่า F2 มีค่ากิจกรรมในการต้านอนุมูลอิสระได้ดีที่สุดเมื่อทำการทดสอบด้วยวิธี NO และABTS โดยมีค่า IC50 เท่ากับ 7.68±0.64 และ 9.74±0.2 ไมโครกรัมโปรตีนต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ จากนั้นนำ F2 ไปทำให้บริสุทธิ์ต่อด้วยเทคนิคโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง ทำให้สามารถคัดแยกเพปไทด์ออกมาได้ 4 ส่วน โดยเพปไทด์ที่แยกได้ในช่วงเวลานาทีที่ 30 – 40 (F2-4) ได้ถูกคัดเลือกนำมาทำการวิเคราะห์เพื่อพิสูจน์เอกลักษณ์ของสารโดยเทคนิคแมสสเปกโตเมตรี พบว่าสามารถคัดแยกเพปไทด์ออกมาได้ 5 ชนิด ได้แก่ AILQSYSAGKTK มีขนาดโมเลกุล 1,265.69 ดาลตัน, ALNKTHLIQTK มีขนาดโมเลกุล 1,265.74 ดาลตัน, LLVHAPVK มีขนาดโมเลกุล 875.55 ดาลตัน, IPDAHPVK มีขนาดโมเลกุล 875.48 ดาลตัน และ VVVLRDGAVQQLGTPR มีขนาดโมเลกุล 1,706.97 ดาลตัน F2-4 มีค่า DPPH และ NO radical scavenging activities สูงที่สุดเมื่อทำการเปรียบเทียบกับเพปไทด์สังเคราะห์ ยิ่งไปกวานี้เพปไทด์สังเคราะห์ AILQSYSAGKTK มีค่า ABTS radical scavenging activities สูงสุด นอกจากนี้เพปไทด์ F2 มีความสามารถในการป้องกันการถูกทำลายของดีเอ็นเอจากพลาสมิด pBR322, pKS และ pUC19 ได้ เพปไทด์ F2 ถูกนำมาศึกษาคุณสมบัติในการต้านการอักเสบและการต้านมะเร็ง โดยผลการวิจัยของการต้านการอักเสบพบว่า F2 ไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์แมคโครฟาจ และได้ทำการทดสอบการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการอักเสบโดยวิธีการ RT-PCR และ qRT-PCR พบว่าสามารถลดการแสดงออกของยีน iNOS, TNF-α, COX-1, COX-2 และ IL-6 ได้ สำหรับฤทธิ์ในการต้านมะเร็งพบว่า F2 สามารถยับยั้งการเกิดเซลล์มะเร็งได้ดีที่สุดในเซลล์มะเร็งลำไส้ SW 620 เมื่อทดสอบด้วยวิธี MTT ซึ่งมีค่า IC50 เท่ากับ 106.58±21.46 ไมโครกรัมโปรตีนต่อมิลลิลิตร F2 สามารถกระตุ้นให้เซลล์มะเร็งลำไส้เกิดการตายแบบอะพอพโทซิสหลังจากบ่มเป็นเวลา 24, 48 และ 72 ชั่วโมง โดยมีการทำงานของเอนไซม์แคสเปส 3 8 และ 9 สูงสุดในชั่วโมงที่ 72 จากผลการวิจัยนี้กล่าวได้ว่าไซยาโนแบคทีเรียชนิดเซลล์เดี่ยว Synechococcus sp. มีความเป็นไปได้ที่จะนำมาใช้เพื่อพัฒนาสำหรับใช้เป็นยาต้านการอักเสบและยาต้านมะเร็งที่ได้มาจากธรรมชาติได้
Description: Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2017
Degree Name: Doctor of Philosophy
Degree Level: Doctoral Degree
Degree Discipline: Biotechnology
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59455
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5672885923.pdf4.11 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.