การศึกษาความแตกต่างแปรผันทางพันธุกรรมในประชากรกุ้งกุลาดำ โดยการตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอ ด้วยตัวตรวจสอบที่มีลำดับเบสซ้ำแบบง่าย : รายงานวิจัยฉบับสมบูรณ์

Abstract

ในการศึกษาความแตกต่างแปรผันทางพันธุกรรมในประชากรกุ้งกุลาดำ ได้ทดสอบวิธีการตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอในกุ้งกุลาดำและได้เลือก 2 วิธี เพื่อใช้ในการศึกษาความแตกต่างแปรผันทางพันธุกรรม คือ 1. การตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอ โดยเทคนิค RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA analysis) และ 2. การตรวจความแปรผันของ microsatellites DNA ในการศึกษานี้ได้เก็บตัวอย่างกุ้งจากแหล่งที่นิยมใช้เป็นพ่อ-แม่พันธุ์ในการเพาะเลี้ยงกุ้ง จำนวน 5 แหล่ง โดยเก็บตัวอย่างจากทะเลอันดามัน 3 แหล่ง ได้แก่ กุ้งบริเวณ จ. สตูล-ตรัง กุ้งจากจ. พังงา และกุ้งจากเมดาน ประเทศอินโดนีเซีย และเก็บตัวอย่างกุ้งจากฝั่งอ่าวไทย 2 แหล่ง ได้แก่ กุ้งจาก จ. ตราด และ จาก จ. ชุมพร โดยแต่ละวิธีได้ผลโดยสรุปได้ดังนี้ การตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอ โดยเทคนิค RAPD จากการวิเคราะห์ RAPD patterns ของกุ้งทั้ง 5 กลุ่ม พบว่ามีจำนวนแถบดีเอ็นเอที่เกิดจาก RAPD primers ทั้ง 7 ตัว รวม 80 แถบ ซึ่งมีขนาดอยู่ในช่วง 200-2000 คู่เบส เมื่อคำนวณค่าเปอร์เซ็นต์ความหลากหลายของแถบดีเอ็นเอ (%polymorphic bands) ในกุ้งแต่ละกลุ่มพบว่ามีค่าใกล้เคียงกันอยู่ในช่วง 51.5-57.7 % ค่า similarity index ภายในกลุ่มประชากรอยู่ในช่วง 0.86-0.89 โดยตัวอย่างกุ้งจากพังงามีค่า similarity ภายในกลุ่มประชากรสูงสุด จากค่า similarlity index ระหว่างกลุ่มประชากร เมื่อนำมาคำนวณค่า genetic distance และสร้าง dendrogram พบว่าตัวอย่างกุ้งกุลาดำจากเมดานมีลักษณะทางพันธุกรรมแตกต่างจากกุ้งของประเทศไทย (Dij=14.976%) และภายในกลุ่มตัวอย่างของกุ้งจากประเทศไทยด้วยกัน สามารถแยกกุ้งสตูล-ตรังออกจากกลุ่มตัวอย่างที่เหลือ (Dij=2.632%) ลายพิมพ์ดีเอ็นเอจากตัวอย่างกุ้งทั้ง 5 กลุ่ม มีลักษณะที่แตกต่างกันทั้งสิ้น 252 แบบ เมื่อนำมาวิเคราะห์ความแตกต่างโดยใช้ไคสแคว์ (chi-square analysis) และเปรียบเทียบระหว่างตัวอย่างกุ้งจากเมดานกับกลุ่มตัวอย่างของประเทศไทย และระหว่างกลุ่มตัวอย่างของประเทศไทยจากทะเลอันดามันและอ่าวไทย พบว่ามีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.0001 และ P=0.0000-0.0387 ตามลำดับ) การตรวจความแปรผันของ microsatellites DNA สามารถแยก microsatellite clones จาก partial genomic library ของกุ้งกุลาดำได้ และจากการหาลำดับนิวคลิโอไทด์ของ microsatellite clones พบว่ามีลำดับชั้นแบสซ้ำเป็นแบบ (GT)n จำนวน 97 clones, (CT)n จำนวน 16 clones และเป็น microsatellites ชนิด perfect,imperfect และ compound ในสัดส่วน 24, 53 และ 23% ตามลำดับ แสดงว่า microsatellites ในกุ้งกุลาดำส่วนใหญ่เป็นชนิด imperfect นอกจากนี้ยังพบว่าจำนวน repeat ในแต่ละ clone มีความยาวตั้งแต่ 6 repeats จนถึงมากกว่า 100 repeats โดยจำนวน repeat ที่พบมากที่สุดอยู่ในช่วง 30-35 repeats จากลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณ flanking regions ของ microsatellite clones นำมาออกแบบ PCR primers เพื่อตรวจหาความแปรผันของ microsatellite loci พบว่ามี 4 loci ที่ให้ PCR product ตามที่คาดไว้ และสามารถ score allele ได้ คือ CUPmo 18, CUPmo386, CUPmo131 และ CUPmo195 เมื่อทำการทดสอบความแปรผันของ microsatellite loci เหล่านี้ โดยนำไปตรวจตัวอย่างกุ้งธรรมชาติ พบว่าทุก loci มีความแปรผันสูง คือ มีจำนวน alleles ที่พบในแต่ละ locus อยู่ในช่วง 14-28 alleles เมื่อนำไปตรวจความแปรผันทางพันธุกรรมในตัวอย่างกุ้ง 4 กลุ่ม คือสตูล ตรัง พังงา และชุมพร โดยการตรวจความแปรผันที่ตำแหน่ง CUPmo18 locus พบว่ากุ้งจากทะเลอันดามัน คือ สตูล ตรัง และพังงา มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (P<0.05) กับกุ้งจากอ่าวไทย คือ กุ้งชุมพร