การแยกให้บริสุทธิ์และการศึกษาสมบัติของแอลคาไลน์โปรตีเอสจากเชื้อ Bacillus Subtilis TISTR 25

Abstract

Bacillus subtilis TISTR 25 เป็นแบคทีเรียที่แยกได้จากดินในประเทศไทย สามารถถูกชักนำให้ผลิตเอนไซม์โปรตีเอสสูงขึ้นได้โดยเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30 ̊ซ ในอาหารสูตรปรับต่ำที่เสริมด้วย 1 เปอร์เซนต์กลูตาเมท pH 6.0 และพบว่าการผลิตเอนไซม์โปรตีเอส ถูกกดดันในสภาวะที่มีน้ำตาลกลูโคสด้วยกระบวนการคาตาบอไลต์ รีเพรสชัน โดยการศึกษาผลของ Ethylenediamine tetraacetic acid และ Phenylmethylsulfonyl fluoride ต่อเอนไซม์แอคติวิตี พบว่าเอนไซม์โปรตีเอสที่แยกได้ในน้ำเลี้ยงเชื้อ ประกอบด้วยนิวทรัลและแอลคาไลน์โปรตีเอสในอัตราส่วนประมาณ 1:3 ซึ่งต่างจากเชื้อมาตรฐาน B. licheniformis ATCC 21415 ที่สร้างเอนไซม์แอลคาไลน์โปรตีเอสเป็นส่วนใหญ่ เมื่อตกตะกอนโปรตีนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต และแยกโดย CM-cellulose คอลัมน์โครมาโตกราฟฟี เอนไซม์แอลคาไลน์โปรตีเอสจากสายพันธุ์ TISTR 25 มีความบริสุทธิ์ขึ้น 2.3 เท่า จากการศึกษาสมบัติของแอลคาไลน์โปรตีเอสที่มีความบริสุทธิ์บางส่วนนี้ พบว่า เอนไซม์เป็นโพลีเพปไทด์สายเดี่ยว ไม่มีหน่วยย่อย และมีน้ำหนักโมเลกุล 27,000 ดาลตัน pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยาคือ 8.5 และ 55 ̊ซ เอนไซม์ไฮโดรไลส์ได้ทั้งสับสเตรตธรรมชาติและสับสเตรตสังเคราะห์ โดยมีค่า K[subscript m] ต่อ casein, hemoglobin และ benzoyl tyrosine ethyl ester (BTEE) เท่ากับ 0.02, 0.07 และ 8.0 มิลลิโมล/ลิตร ตามลำดับ และมีค่า K[subscript m] ต่อ azocasein, azocoll คือ 3.03 และ 33.33 มก./มล. เอนไซม์มีความจำเพาะในการไฮโดรไลส์พันธะเพปไทด์ที่ปลายคาร์บอกซิลของกรดอะมิโน อาร์จินีน อะลานีน ลูซีน เฟนิลอะลานีน และเวลีน แอลคาไลส์โปรตีเอสที่แยกได้จาก B. subtilis TISTR 25 นี้ มีสมบัติบางประการต่างจากเอนไซม์ Subtilisin Carlsberg คือ pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยา รวมทั้งแอฟฟินิตีต่อ casein และ BTEE ซึ่งคาดว่าเอนไซม์ทั้งสอง อาจมีส่วนประกอบกรดอะมิโนในบริเวณ binding site ต่างกัน เมื่อศึกษาความจำเพาะของเอนไซม์ในการไฮโดรไลส์พันธะเพปไทด์ โดยการวิเคราะห์ด้วยวิธีสเปคโตรโฟโตเมตรี และ TLC พบว่า เอนไซม์ที่แยกได้มีความจำเพาะไม่ต่างจากเอนไซม์ Subtilisin Carlsberg และ Nagarse แต่ต่างจากเอนไซม์ Trypsin ในสภาวะที่ทำการทดลอง