Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/2462
Title: Diagnosis of beta-globin gene mutations in single blastomere by reverse dot blot hybridization
Other Titles: การวินิจฉัยความผิดปกติของยีนเบต้ากลอบบินของเซลล์เดี่ยวตัวอ่อนโดยวิธีรีเวอร์สดอทบล็อทไฮบริไดเซชั่น
Authors: Jiraporn Pansatha
Advisors: Kamthorn Pruksananonda
Pranee Sutcharitchan
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Medicine
Advisor's Email: Kamthorn.P@Chula.ac.th
Pranee.S@Chula.ac.th
Subjects: Prenatal diagnosis
Hybridization
Thalassemia
Issue Date: 2003
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: BACKGROUND: Reverse dot blot hybridization (RDB) has been employed for prenatal diagnosis (PND) of beta thalassemia due to the variety of point mutation of beta globin gene. This study try to apply this technique performed preimplantation genetic diagnosis (PGD) for beta thalassemia. The quality and quantity of PCR product is the key factor for successful hybridization of RDB. PCR reactions were modified for single blastomere to provide adequate PCR product for hybridization. METHODS: Two-step (nested) PCR was performed to amplify beta globin gene. The genomic DNA was serial diluted for determining the minimum DNA concentration could be amplified. One hundred and six single blastomeres were subjected to genotype. The optimization of annealing temperature, changing nested primer and comparing lysis method was evaluated by genotyping of 25, 50 and 256 single blastomeres respectively. Amplified product was diagnosed beta globin mutation for RDB. RESULTS:The minimum DNA concentration successful amplified was 12.5 pg. Twenty-eight of 106 (26.4%) single blastomeres were successful amplified. The optimized annealing temperature was 58 ํC. Amplification efficiency of changing location of nested PCR primer was 22.0%. The optimized primer concentration was 0.1 micrometre. Comparing five lysis methods (i) boiling in water at 94 ํC for 15 (ii) 30 min, (III) incubation in an alkali lysis buffer for 30 min at 94 ํC or (iv) at 65 C for 10 min, and (v) boiling in TE buffer at 95 ํC for 10 min. the amplification percentages were formed to be 58, 10.8, 0, 0 and 55.4% respectively. Applications of reverse dot blot hybridization to detect beta globin gene mutation of amplified DNA from 10 pg DNA of which known mutation, it was found that the detection of beta globin gene mutations were all correct. Amplified DNA from single blastomere successful hybridized. CONCLUSION : At the present study, amplification efficiency of beta globin gene in single blastomere is quite low, so that it is not appropriate for clinical applications.
Other Abstract: เหตุผลของการศึกษา เทคนิครีเวอร์สดอทบล็อทไฮบริไดเซชั่นเป็นวิธีที่ใช้ในการวินิจฉัยทารกก่อนคลอด ของโรคเบต้าธาลัสซีเมีย เนื่องจากยีนเบต้ากลอบบินมีชนิดการกลายพันธุ์ที่หลากหลาย ซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากเบสเปลี่ยนแปลงไปเฉพาะจุด การศึกษาวิจัยครั้งนี้คือการนำเทคนิคนี้ มาใช้ในการตรวจตัวอ่อนก่อนการย้ายฝากในโพรงมดลูก ซึ่งเป็นการวินิจฉัยความผิดปกติของยีนเบต้าธาลัสซีเมียในระดับดีเอ็นเอของบลาสโตเมียร์เดี่ยว คุณภาพและปริมาณของผลิตผลจาก พีซีอาร์ เป็นปัจจัยสำคัญของการทำไฮบริไดเซชั่น ของเทคนิครีเวอร์สดอทบล็อทไฮบริไดเซชั่น ปฏิกริยาพีซีอาร์จะถูกปรับเปลี่ยนให้เหมาะสม เพื่อเพิ่มปริมาณยีนเบต้ากลอบบินให้เพียงพอ สำหรับการตรวจกรองความผิดปกติของยีนเบต้า กลอบบิน โดยวิธีรีเวอร์สดอทบล็อทไฮบริไดเซชั่นต่อไป วิธีการ การวิจัยมุ่งประเด็นที่จะแก้ปัญหาการหาสภาวะที่เหมาะสมในการเพิ่มปริมาณยีนเบต้ากลอบบินของเซลล์เดี่ยวตัวอ่อนโดยใช้การทำพีซีอาร์ 2 ขั้นตอน เริ่มต้นจากการหาความเข้มข้นของดีเอ็นเอจากเลือดที่ต่ำที่สุดที่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นได้ จากนั้นทำการเพิ่มปริมาณยีนเบต้ากลอบบินของบลาสโตเมียร์เดี่ยวจำนวน 106 เซลล์ การหาอุณหภูมิแอลนีลลิ่งที่เหมาะสม การศึกษาผลของไพรเมอร์คู่ในต่อการทำพีซีอาร์ และศึกษาเปรียบเทียบวิธีไลสีสเซลล์ ใช้บลาสโตเมียร์เดี่ยว 25 50 และ 256 เซลล์ ตามลำดับ ขั้นตอนสุดท้าย วินิจฉัยการกลายพันธุ์ของยีนเบต้ากลอบบิน ของดีเอ็นเอจากเลือดและและบลาสโตเมียร์เดี่ยวที่เพิ่มปริมาณเอ็นเอแล้ว ผลการศึกษา เมื่อเพิ่มปริมาณ ดีเอ็นเอจากเลือดที่ลดความเข้มข้นเป็นลำดับ สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของเลือดลดความเข้มข้นจนถึงระดับต่ำสุดที่ 12.5 พิโครกรัม เมื่อเพิ่มปริมาณยีนเบต้ากลอบบินของบลาสโตเมียร์เดี่ยว มีอัตราความสำเร็จเท่ากับร้อยละ 26.4 ซึ่งค่อนข้างต่ำ จึงทำการปรับองค์ประกอบของการทำพีซีอาร์ เริ่มจากการปรับอุณหภูมิแอลนีลลิ่ง พบว่าที่อุณหภูมิ 58 องศาเซนเซียส สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้สำเร็จ ศึกษาผลของไพรเมอร์ต่อการทำพีซีอาร์ จึงทำการเปลี่ยนเนสเต็ดไพรเมอร์ อัตราความสำเร็จในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเพียงร้อยละ 22 เมื่อเปลี่ยนไพรเมอร์คู่นอกและปรับสภาวะในการทำพีซีอาร์ อีกครั้ง พร้อมกับการไตเตรดความเข้มข้นของไพรเมอร์ พบว่าความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่เหมาะสมคือ 0.1 ไมโครโมลาร์ จึงใช้สภาวะที่เหมาะสมนี้ในการศึกษาเปรียบเทียบวิธีไลสีสเซลล์ พบว่าไม่มีความแตกต่างระหว่างวิธีที่ใช้น้ำ (ต้มที่ 94 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 15 นาที) กับวิธีที่ใช้ทีอีบัฟเฟอร์ (ต้มที่ 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที) ซึ่งให้อัตราความสำเร็จในการเพิ่มปริมาณยีน เบต้ากลอบบินของเซลล์เดี่ยวตัวอ่อนเท่ากับ ร้อยละ 58 และ 55.4 ตามลำดับ ต่างจากการใช้อัลคาไลน์ บัฟเฟอร์ ซึ่งให้อัตราความสำเร็จในการเพิ่มปริมาณยีนเบต้ากลอบบินของเซลล์เดี่ยวตัวอ่อนร้อยละ 0 ในการทดลองสุดท้าย นำดีเอ็นเอที่เพิ่มปริมาณแล้วจากดีเอ็นเอ 10 พิโครกรัม ที่ทราบตำแหน่งการกลายพันธุ์ของยีนเบต้ากลอบบินแล้วมาตรวจสอบตำแหน่งการกลายพันธุ์อีกครั้ง เพื่อตรวจสอบความถูกต้องและแม่นยำของวิธีเรีเวอร์สดอทบล็อทไฮบริไดเซชั่น พบว่าตำแหน่งการกลายพันธุ์ทุกตำแหน่งถูกต้องตรงกับผลการตรวจเดิม บลาสโตเมียร์เดี่ยวที่เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอแล้วประสบผลสำเร็จในการทำไฮบริไดเซชั่นเช่นกัน สรุป การศึกษาครั้งนี้ ประสิทธิภาพของการเพิ่มขยายดีเอ็นเอจำเพาะในเซลล์เดี่ยวตัวอ่อนด้วยเทคนิคพีซีอาร์ 2 ขั้นตอน ยังมีประสิทธิภาพค่อนข้างต่ำ จึงยังไม่สมควรที่จะนำวิธีรีเวอร์สดอทบล็อทไฮบริไดเซชั่น มาใช้ในการวินิจฉัยความผิดปกติของยีนเบต้ากลอบบิน ในตัวอ่อนของคน ก่อนที่จะได้นำไปฝังตัวในมดลูกได้
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2003
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Medical Science
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/2462
ISBN: 9741735103
Type: Thesis
Appears in Collections:Med - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Jiraporn.pdf783.64 kBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.