Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60979
| Title: | การโคลนการแสดงออกการทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติของอินูลิเนสจาก Streptomyces sp. CP01 ใน Escherichia coli |
| Other Titles: | Cloning, expression, purification and characterization of Streptomyces sp. CP01 inulinase in Escherichia coli |
| Authors: | สุภาภรณ์ วะน้ำค้าง |
| Advisors: | วันชัย อัศวลาภสกุล |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์ |
| Subjects: | ฟรักโทส อินูลิน Fructose Inulin |
| Issue Date: | 2559 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | เนื่องจากความหลากหลายในการประยุกต์การใช้งานจากฟรุกโทสและฟรุกโตโอลิโกแซกคาไรด์ เป็นสารที่มีประโยชน์และเป็นที่ต้องการในทางอุตสาหกรรมอาหาร และทางการแพทย์ จึงมีความต้องการในการผลิตสารดังกล่าวเป็นปริมาณมาก ในกระบวนการผลิตฟรุกโทสจะใช้โพลิแซคคาไรด์จำพวกแป้งเป็นสารตั้งต้นในกระบวนการผลิตและฟรุกโทสที่ได้มีความบริสุทธิ์ที่ต่ำ ปัจจุบันกระบวนการผลิตฟรุกโทสและฟรุกโตโอลิโกแซกคาไรด์ให้ได้พร้อมกัน โดยใช้เอนโดอินูลิเนส ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่พบได้ในจุลินทรีย์บางชนิด อาทิเช่น Arthrobacter sp., Aspergillus sp. และ Penicillium sp. เป็นต้น ดังนั้นในงานวิจัยนี้ได้ทำการโคลนยีนประมวลรหัสอินูลิเนสจาก Streptomyces sp. CP01 เพื่อที่จะผลิตอินูลิเนสให้ได้จำนวนมาก และด้วยเหตุว่าลำดับเบสของอินูลิเนสยังไม่ถูกค้นพบ จึงได้ออกแบบ degenerated primers จากแบคทีเรียที่ผลิตเอนโดอินูลิเนสได้แล้วทำการเพิ่มจำนวนยีนโดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส เพื่อให้ได้ลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีนประมวลรหัสอินูลิเนสของ Streptomyces sp. CP01 หลังจากนั้นจึงนำลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีนไปทำการเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ผ่านทางคอมพิวเตอร์ (BLAST, ฐานข้อมูล NCBI) พบว่ามีความคล้ายคลึงกับเอนโดอินูลิเนสของ Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 จากนั้นจึงได้ทำการออกแบบไพร์เมอร์จำเพาะเพื่อโคลนยีนประมวลรหัสอินูลิเนสของ Streptomyces sp.CP01 พบว่ายีนประมวลรหัสอินูลิเนสมีความยาว 2,892 นิวคลีโอไทด์ แปลรหัสเป็นกรดอะมิโนได้ 963 กรดอะมิโน จากนั้นจึงนำยีนดังกล่าวเชื่อมกับเวกเตอร์ pET28a (+) และถ่ายโอนเข้าสู่ Escherichia coli สายพันธุ์ Rosetta-gami (DE3)pLys S และ BL21(DE3) เพื่อเหนี่ยวนำการแสดงออกด้วย 0.1mM IPTG ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เพื่อตรวจสอบการแสดงออกด้วย SDS-PAGE และ Western blotting analysis พบโปรตีนที่ขนาดประมาณ 107 กิโลดาลตัน ละลายอยู่ในส่วนน้ำใสบางส่วน และมีกิจกรรมเอนไซม์อินูลิเนส พบว่าอินูลิเนสที่ได้จากรีคอมบิแนนท์โคลน Rosetta-pET28a-SA34 มีกิจกรรมเอนไซม์อินูลิเนสสูงที่สุด จึงนำโปรตีนรีคอมบิแนนท์อินูลิเนสจากโคลนดังกล่าวมาทำให้บริสุทธิ์ด้วย Affinity Column Chromatography และนำมาทดสอบสมบัติของเอนไซม์ พบว่าสภาวะเหมาะสมในการทำปฏิกิริยาของรีคอมบิแนนท์อินูลิเนส คือสภาวะอุณหภูมิที่ 40 o C pH 7 และความเข้มข้นอินูลินที่เหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยา คือ 20 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร เมื่อศึกษาค่าทางจลนพลศาสตร์ของรีคอมบิแนนท์อินูลิเนส พบว่าค่าคงที่ของ Michaelis-Menten (Km) เท่ากับ 11 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร และความเร็วสูงสุดของเอนไซม์ (Vmax) เท่ากับ 0.088 มิลลิกรัม/นาที/มิลลิลิตร และเมื่อนำรีคอมบิแนนท์อินูลิเนสมาทดสอบการย่อยเพื่อหาผลิตภัณฑ์ที่เอนไซม์ย่อยได้ด้วยวิธี Thin Layer Chromatography พบว่ารีคอมบิแนนท์อินูลิเนสสามารถย่อยอินูลินได้เป็นซูโครสและฟรุกโตโอลิโกแซกคาไรด์บางส่วน |
| Other Abstract: | Due to the versatile applications of fructose and fructooligosaccharide (FOS) in food industry and medical areas, high demand in massive production of these compunds is called-for. In fructose manufacturing process, polysaccharides such as starch generally serve as the precursor for fructose production but yielding the product with low quality via chemical processes. Recently, inulinase; an enzyme responsible for hydrolysis of inulin found in several microorganisms, e.g., Arthrobacter sp., Aspergillus sp. and Penicillium sp., etc. has been used to simultaneously produce fructooligosaccharides and fructose. Therefore, this project is focused on overproducing inulinase in Streptomyces sp. CP01 using molecular cloning as the tool. Because the sequence of the inulinase has not been established, degenerated primers were designed based on the conserved sequence of the protein followed by PCR amplification. After the contig sequencing and in silico alignment (BLAST, NCBI database), the PCR product showed high sequence similarity to the inulinase in Streptomyces ambofaciens ATCC 23877, suggesting the putative gene is endo-inulinase. Subsequently, specific primers were thus constructed to clone the gene encoded for inulinase in Streptomyces sp.CP01. The sequencing data indicated that the cloned gene consisted of 2,892 nucleotides encoding for 963 amino acids. Then, the target gene was ligated into pET28a(+) vector and transformed into Escherichia coli Rosetta-gami (DE3)pLys S and BL21(DE3) to overexpress the protein by 0.1mM IPTG induction at 30°C. Characterized by SDS-PAGE and Western blot, the cloned protein has the molecular weight of 107 kDa with hydrolytic activity towards inuline but showed partial solubility in aqueous phase. The inulinase derived from Rosetta-pET28a-SA34 exhibited the highest activity to inulin and thus was deliberately selected for testing enzymatic property after purification through affinity column chromatography. After optimizing the condition for inulin digestion, the reaction condition facilitating the work of recombinant enzyme is 40 °C at pH 7 with the optimal concentration of 20 mg/ml. In addition, the kinetics of the enzyme were studied and obtained as Michaelis-Menten parameters including the Michaelis-Menten constant (Km) and maximum rate of the reaction (Vmax) with the value of 11 mg/mL and 0.088 mg/min/ml, respectively. The result also suggested that the recombinant protein can partially hydrolyze inulin to sucrose and fructose as confirmed by Thin Layer Chromatography. |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2559 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | จุลชีววิทยาและเทคโนโลยีจุลินทรีย์ |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60979 |
| URI: | http://doi.org/10.58837/CHULA.THE.2016.323 |
| metadata.dc.identifier.DOI: | 10.58837/CHULA.THE.2016.323 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Sci - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| 5672122723.pdf | 6.34 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.