การตรวจการกลายพันธุ์ของยีน K-ras ในตัวอย่างชิ้นเนื้อที่ฝังพาราฟิน ของผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่และไส้ตรง โดยวิธี Multiplex Allele-Specific Polymerase Chain Reaction

ศิริรัตน์ สีขุนทด

dc.contributor.advisor	นันทรี ชัยชนะวงศาโรจน์
dc.contributor.advisor	ภานินี ถาวรังกูร
dc.contributor.author	ศิริรัตน์ สีขุนทด
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสหเวชศาสตร์
dc.date.accessioned	2017-11-27T09:33:25Z
dc.date.available	2017-11-27T09:33:25Z
dc.date.issued	2558
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/56360
dc.description	วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2558
dc.description.abstract	ผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่และไส้ตรง ที่มีการกลายพันธุ์ของยีน K-ras (V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) จะไม่ตอบสนองต่อการให้ยาเคมีบำบัดชนิดโมโนโคลนอล แอนติบอดี ที่จะไปยับยั้งการส่งสัญญาณบนผิวเซลล์ของ epidermal growth factor receptor (EGFR) จึงมีความจำเป็นในการตรวจวิเคราะห์การกลายพันธุ์ของยีน K-ras ก่อนการให้ยากับผู้ป่วยเพื่อช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการรักษาให้เหมาะสมกับผู้ป่วยแต่ละราย ในการศึกษาครั้งนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาวิธี Multiplex Allele-Specific PCR (MAS-PCR) ในการตรวจหาการกลายพันธุ์ของยีน K-ras ที่ตำแหน่งโคดอน 12 และ 13 นิวคลีโอไทด์ที่ 34 35 และ 38 ทั้งสิ้น 7 ชนิด คือชนิด G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, และ G13D ในหลอดทดลองเดียว ตัวอย่างชิ้นเนื้อที่ฝังพาราฟินของผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่และไส้ตรง จำนวน 270 ตัวอย่าง ทำการตรวจวิเคราะห์กับ AS-primer ที่จำเพาะกับดีเอ็นเอชนิดไม่กลายพันธุ์และ AS-primer ที่จำเพาะกับดีเอ็นเอชนิดกลายพันธุ์ ทดสอบหาขีดจำกัดต่ำสุด (เปอร์เซ็นต์ mutant allele) ที่วิธี MAS-PCR สามารถตรวจวัดได้ ผลการศึกษาพบว่าวิธี MAS-PCR ที่ใช้ AS-primers ที่จำเพาะกับดีเอ็นเอชนิดไม่กลายพันธุ์ สามารถแยกการกลายพันธุ์ของยีน K-ras ออกจากดีเอ็นเอชนิดไม่กลายพันธุ์ได้ แต่ไม่สามารถระบุชนิดการกลายพันธุ์ได้ ขีดจำกัดต่ำสุดที่ตรวจวัดได้ที่ 50-55 เปอร์เซ็นต์ mutant allele ขณะที่วิธี MAS-PCR ที่ใช้ AS-primers ที่จำเพาะกับดีเอ็นเอชนิดกลายพันธุ์ 7 ชนิดนั้น สามารถระบุชนิดการกลายพันธุ์ได้ ยิ่งไปกว่านั้น ตัวอย่างชิ้นเนื้อที่ฝังพาราฟินจำนวน 270 ตัวอย่าง ที่ตรวจวิเคราะห์ด้วยวิธี MAS-PCR ให้ผลการตรวจวิเคราะห์ที่สอดคล้องกับวิธี Pyrosequencing ในระดับดีมาก (k = 0.947) มีเพียง 7 ตัวอย่างเท่านั้น ที่ให้ผลไม่สอดคล้องกัน วิธี MAS-PCR สามารถตรวจวิเคราะห์การกลายพันธุ์ได้ต่ำสุดที่ 1-2 เปอร์เซ็นต์ mutant allele ชนิดการกลายพันธุ์ที่พบได้บ่อยคือ ชนิดการกลายพันธุ์ G13D ที่ตำแหน่งโคดอน 13 คิดเป็น 49.17 เปอร์เซ็นต์ ชนิดการกลายพันธุ์ G12D คิดเป็น 25.83 เปอร์เซ็นต์ และชนิดการกลายพันธุ์ G12V คิดเป็น 12.50 เปอร์เซ็นต์ ที่ตำแหน่งโคดอน 12 ไม่พบความสัมพันธ์ระหว่างการเกิดการกลายพันธุ์ของยีน K-ras กับลักษณะพื้นฐานทั่วไปของผู้ป่วย ที่เกี่ยวข้องกับ อายุ เพศ ลักษณะทางพยาธิวิทยาของชื้นเนื้อ และตำแหน่งของก้อนมะเร็ง วิธี MAS-PCR ที่พัฒนาขึ้นสามารถนำไปประยุกต์ใช้ในการตรวจวิเคราะห์การกลายพันธุ์ของยีน K-ras ในตัวอย่างชิ้นเนื้อที่ฝังพาราฟินของผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่และไส้ตรง ซึ่งเป็นวิธีที่น่าเชื่อถือ รวดเร็ว ราคาไม่แพง และไม่จำเป็นต้องใช้เครื่องมือขั้นสูง
dc.description.abstractalternative	Colorectal cancer patients with K-ras (V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) mutations do not respond to epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors and fail to benefit from adjuvant chemotherapy. Mutation analysis of K-ras is necessary before starting treatment with monoclonal anti-EGFR antibodies for effective and appropriate treatment for individual patients. The objective of this study is to develop a Multiplex Allele-Specific PCR (MAS-PCR) assay for analysis of the mutational status of K-ras codons 12 and 13, at nucleotides 34, 35 and 38, including 7 type of K-ras mutations (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, and G13D) in a single-tube. Two hundred and seventy of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues were analyzed using AS-primers specific for wild-type DNA and AS-primers specific for mutant DNA. The limit of detection (% mutant allele) of the MAS-PCR assay was determined. MAS-PCR assay using AS-primes specific for wild-type DNA could separate K-ras mutations from wild-type DNA, but it could not identify specific type of mutations. The limit of detection was detected at 50-55% mutant allele. While MAS-PCR assay using AS-primers specific for each of seven K-ras point mutations were successfully amplify each mutant alleles. Moreover, the MAS-PCR analysis of 270 FFPE samples shown good concordance (k = 0.947) with Pyrosequencing, only seven discordant samples were found. The MAS-PCR assay reproducibly detected 1 to 2% mutant alleles. The most common mutations were G13D in codon 13 (49.17%), G12D (25.83%) and G12V (12.50%) in codon 12. No correlation was found between K-ras mutations and patient’s demographic characteristics regard to age, gender, histologic grade and tumor site. Our developed MAS-PCR can applied for detection of K-ras gene mutations in FFPE colorectal cancer tissues which is a reliable, rapid, cost-effective method and no need of advance instruments.
dc.language.iso	th
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.title	การตรวจการกลายพันธุ์ของยีน K-ras ในตัวอย่างชิ้นเนื้อที่ฝังพาราฟิน ของผู้ป่วยมะเร็งลำไส้ใหญ่และไส้ตรง โดยวิธี Multiplex Allele-Specific Polymerase Chain Reaction
dc.title.alternative	DETECTION OF K-ras GENE MUTATION FROM FORMALIN-FIXED, PARAFFIN-EMBEDDED TISSUE AMONG COLORECTAL CANCER PATIENTS BY MULTIPLEX ALLELE-SPECIFIC POLYMERASE CHAIN REACTION
dc.type	Thesis
dc.degree.name	วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
dc.degree.level	ปริญญาโท
dc.degree.discipline	วิทยาศาสตร์ระดับโมเลกุลทางจุลชีววิทยาทางการแพทย์และวิทยาภูมิคุ้มกัน
dc.degree.grantor	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.email.advisor	Nuntaree.C@Chula.ac.th,nuntaree@gmail.com,Nuntaree.C@chula.ac.th
dc.email.advisor	paninee@health.moph.go.th