การผลิตรีคอมบิแนนต์โปรตีนจากบางส่วนของยีนยูนีคซ๊อต 8 ของไวรัสพิษสุนัขบ้าเทียม

ศุภฤกษ์ นันทวัน ณ อยุธยา

dc.contributor.advisor	รุ่งโรจน์ ธนาวงษ์นุเวช
dc.contributor.author	ศุภฤกษ์ นันทวัน ณ อยุธยา
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสัตวแพทยศาสตร์
dc.date.accessioned	2018-09-06T08:00:36Z
dc.date.available	2018-09-06T08:00:36Z
dc.date.issued	2553
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59398
dc.description	วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2553	en_US
dc.description.abstract	โรคพิษสุนัขบ้าเทียมเป็นโรคประจำถิ่นของประเทศไทย และก่อความเสียหายให้แก่อุตสาหกรรรมการเลี้ยงสุกรของประเทศไทยอยู่เป็นระยะๆ การศึกษาในครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อผลิตโปรตีนจากยีนยูนีคซ๊อต 8 ของไวรัสพิษสุนัขบ้าเทียมเพื่อนำไปพัฒนาเป็นชุดทดสอบโรคพิษสุนัขบ้าเทียมชนิดอิมมูนโนโครมาโตกราฟฟิก โดยการศึกษานี้ใช้ไวรัสพิษสุนัขบ้าเทียมสายพันธุ์ 8NP74 นำมาเพิ่มจำนวนดีเอนเอที่ตำแหน่งนิวคลีโอไทด์ที่ 156 ถึง 714 ของยีนยูนีคช๊อต 8 ด้วยปฎิกริยาลูกโซ่โพลิเมอร์เรส นำผลผลิต gE fragment (ขนาด 573 คู่เบส) ดังกล่าวไปโคลนเข้าพลาสมิด pGEM-Teasy ให้ชื่อเป็น พลาสมิด gE pGEM-T แล้วใส่เข้าไปในแบคทีเรียอีโคไลสายพันธุ์ JM109 ทำการเพิ่มจำนวนแบคทีเรียแล้วสกัดพลาสมิด gE pGEM-T ออกมาจากแบคทีเรีย และทำการตัดด้วยเอนไซม์ EcoRI ก่อนทำการเชื่อมต่อส่วนของยีนยูนีคซ๊อต 8 ที่ถูกตัดออกมาเข้าสู่พลาสมิด pGEX 5x-3 ซึ่งใช้เป็น expression vector โดยใช้แบคทีเรียอีโคไลสายพันธุ์ Rosetta DE3 plysS เป็นแบคทีเรียที่ทำหน้าที่ผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีน ตรวจสอบความถูกต้องของลำดับนิวคลีโอไทด์ก่อนทำการกระตุ้นแบคทีเรียให้ทำการสร้างรีคอมบิแนนท์โปรตีน gE นำรีคอมบิแนนท์โปรตีนที่ผลิตได้ไปทดสอบ Western immunoblotting analysis โดยใช้ซีรัมสุกรที่ให้ผลบวกกับไวรัสพิษสุนัขบ้าเทียมด้วยวิธีอีไลซา (HerdCheck Anti-ADV gpI, IDEXX, USA) และนำไปเปรียบเทียบกับโปรตีนที่สกัดจากแบคทีเรียควบคุม พบการติดสีน้ำตาลที่แถบโปรตีนขนาดประมาณ 47 กิโลดาลตัน นำโปรตีนที่ได้ไปทดสอบ Dot blot analysis พบว่าสามารถทำปฎิกริยากับซีรัมสุกรที่ให้ผลบวกกับไวรัสพิษสุนัขบ้าเทียมด้วยวิธีอีไลซาได้ จากการศึกษาในครั้งนี้สามารถผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีน gE จากยีนยูนีคซ๊อต 8 ได้และมีความเป็นไปได้ที่จะสามารถนำไปพัฒนาเป็นชุดทดสอบโรคพิษสุนัขบ้าเทียมชนิดอิมมูโนโครมาโตกราฟฟิกได้	en_US
dc.description.abstractalternative	Aujeszky’s disease or Pseudorabies is an endemic disease causing economic losses to the Thai swine industries. The objective of this study is to produce recombinant protein from unique short 8 gene (Us 8) of pseudorabies virus and to develop immunochromatographic strip test for detecting pseudorabies–infected pigs. Nucleotides 156 to 174 of a wild type pseudorabies virus (8NP74) Us 8 gene were amplified by using polymerase chain reaction (PCR) and the PCR product was cloned into pGEM-Teasy plasmid and named gE pGEM-T. This plasmid was transformed into E. coli JM109 strain. After culturing, gE pGEM-T plasmid was extracted and cut with enzyme EcoRI. The cut sequence was cloned into pGEX 5x-3 expression vector. E. coli rosetta DE3 plysS was used for producing gE recombinant protein. Nucleotide sequence was again checked before gE recombinant protein production. Recombinant protein was tested by western immunoblotting analysis using known ELISA positive swine serum (HerdCheck Anti-ADV gpI, IDEXX, USA) and compared to the protein from the control bacteria. The result showed reaction at protein size around 47 kDa. Recombinant protein was purified and tested using dot blot analysis. Positive reaction to known pseudorabies positive serum was demonstrated. From this study, gE recombinant protein was successfully produced using E. coli and potentially used for pseudorabies virus immunochromatographic test development.	en_US
dc.language.iso	th	en_US
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.relation.uri	http://doi.org/10.14457/CU.the.2010.1602
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.subject	สุกร -- โรคเกิดจากไวรัส	en_US
dc.subject	โรคกลัวน้ำ	en_US
dc.subject	วัคซีนสัตว์	en_US
dc.subject	Swine -- Virus diseases	en_US
dc.subject	Rabies	en_US
dc.subject	Veterinary vaccines	en_US
dc.title	การผลิตรีคอมบิแนนต์โปรตีนจากบางส่วนของยีนยูนีคซ๊อต 8 ของไวรัสพิษสุนัขบ้าเทียม	en_US
dc.title.alternative	The production of recombinant protein from a partial of pseudorabies virus unique short 8 gene	en_US
dc.type	Thesis	en_US
dc.degree.name	วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต	en_US
dc.degree.level	ปริญญาโท	en_US
dc.degree.discipline	พยาธิชีววิทยาทางสัตวแพทย์	en_US
dc.degree.grantor	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.email.advisor	Roongroje.T@Chula.ac.th
dc.identifier.DOI	10.14457/CU.the.2010.1602