การแยกเชื้อไวรัสไข้เลือดออกที่มีชีวิตจากปัสสาวะของผู้ป่วยระยะติดเชื้อเฉียบพลัน

อาธิกยา สว่างวารี

dc.contributor.advisor	วันล่า กุลวิชิต
dc.contributor.author	อาธิกยา สว่างวารี
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะแพทยศาสตร์
dc.date.accessioned	2020-11-11T10:06:34Z
dc.date.available	2020-11-11T10:06:34Z
dc.date.issued	2557
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/69412
dc.description	วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2557
dc.description.abstract	ไวรัสเด็งกีเป็นสาเหตุของโรคไข้เลือดออกที่มียุงลายเป็นพาหะนำโรค การตรวจวินิจฉัยในห้องปฏิบัติการ โดยการตรวจหาจีโนมของไวรัสจากเลือดของผู้ป่วยระยะที่มีการติดเชื้อในกระแสเลือด (มีไข้สูง) และยังมีการพัฒนาวิธีการตรวจหาที่มีความไวและรวดเร็วมากขึ้น เช่น Real time RT-PCR ทำให้สามารถตรวจหาจีโนมของไวรัสเด็งกีในปัสสาวะได้ในเวลาต่อมา ดังนั้น ปัสสาวะจึงเป็นตัวอย่างจากผู้ป่วยที่น่าสนใจ และเป็นทางเลือกในการตรวจวินิจฉัย สำหรับผู้ป่วยที่ยากต่อการเจาะเลือดเช่น เด็กเล็ก และผู้ป่วยที่มีอาการเลือดออกอย่างรุนแรง และข้อดีอีกประการหนึ่ง คือ เก็บง่าย และได้ตัวอย่างครั้งละปริมาณมาก จากการตรวจหาจีโนมของไวรัสเด็งกีในปัสสาวะได้นั้น ทำให้เกิดคำถามว่า ไวรัสเด็งกีที่หลั่งออกมาพร้อมกับปัสสาวะ จะยังคงมีชีวิตอยู่หรือไม่ ทำให้เกิดคำถามที่น่าสนใจว่า จีโนมที่ตรวจพบได้ในปัสสาวะนั้น มาจากไวรัสเด็งกีที่ยังคงมีชีวิตอยู่หรือไม่ เนื่องจากหากปัสสาวะของผู้ป่วยมีไวรัสที่มีชีวิต ปัสสาวะดังกล่าวอาจมีบทบาทเกี่ยวข้องกับการแพร่เชื้อในธรรมชาติได้ การวิจัยครั้งนี้ มีวัตถุประสงค์เพื่อแยกเชื้อไวรัสเด็งกีที่มีชีวิตจากปัสสาวะผู้ป่วย โดยทำการประเมินจากผลการตรวจหาจีโนมและโปรตีนของไวรัสในเนื้อเยื่อยุงลาย และจากเซลล์เพาะเลี้ยง โดยวิธีการแยกเชื้อ จากการศึกษาในกลุ่มตัวอย่างซึ่งเป็นปัสสาวะของผู้ป่วยไข้เลือดออกในระยะติดเชื้อเฉียบพลัน จำนวน 2 กลุ่ม ได้แก่ 1. กลุ่มทดลอง คือ ปัสสาวะที่มีผลการตรวจด้วยวิธี RT-PCR และ ELISA ให้ผลบวก จำนวน 15 ตัวอย่าง ฉีดเข้าสู่ยุงลายและวิธีแยกเชื้อในเซลล์เพาะเลี้ยง C6/36 จำนวน 40 ตัวอย่าง 2. กลุ่มควบคุมคือ ปัสสาวะที่มีผลการตรวจด้วยวิธี RT-PCR และ ELISA รายงานผลลบ อีกส่วนของการทดลองเป็นการศึกษาว่ายุงลายมีพฤติกรรมการดื่มปัสสาวะหรือไม่ โดยศึกษาในปัสสาวะที่มีผล RT-PCR และ ELISA ที่มีผลบวก จำนวน 5 ตัวอย่าง จากการผลศึกษาพบว่า สามารถตรวจพบจีโนมของไวรัสเด็งกีจากการทำ RT-PCR ในยุงลายคิดเป็น 100% (13/13) และในเซลล์เพาะเลี้ยงคิดเป็นอัตรา 100% (5/5) ตามลำดับ เมื่อทำการตรวจหาโปรตีนของไวรัสเด็งกีในเซลล์เพาะเลี้ยงด้วยวิธี Immunocytochemistry สามารถตรวจพบ 70% (28/70) แต่ไม่สามารถตรวจได้ในเนื้อเยื่อหัวยุงลาย เนื่องจากปัญหาผลบวกปลอม จึงไม่สามารถแปลผลได้ สรุปการแยกเชื้อไวรัสเด็งกีที่มีชีวิตเทียบเป็นเปอร์เซ็นต์ พบว่าการแยกเชื้อในยุงลายโดยการตรวจหาจีโนมของไวรัสเด็งกี มีอัตราสูงกว่าการแยกเชื้อในเซลล์เพาะเลี้ยงจากการตรวจหาโปรตีนของไวรัสเด็งกีอย่างมีนัยสำคัญ (P=0.007 เมื่อกำหนดให้ P < 0.05) และผลจากการให้ยุงดื่มปัสสาวะ ผลการตรวจหาจีโนมของไวรัสเด็งกีในเนื้อเยื่อยุงลาย คือไม่พบไวรัสเด็งกี ทั้งนี้ได้ทำการเทียบผลกับ internal control ให้ผลบวกทุกตัวจากการตรวจหา defensin A ที่เป็นจีโนมของ Aedes aegypti (house keeping gene) จึงสรุปได้ว่าไวรัสเด็งกีในปัสสาวะของผู้ป่วยอาจจะยังคงมีชีวิตหลงเหลืออยู่ เนื่องจากสามารถทำการเพาะเลี้ยงในยุงลายและเซลล์เพาะเลี้ยงได้ ดังนั้น การตรวจพบการมีชีวิตอยู่ของไวรัสในสารคัดหลั่งเช่น ปัสสาวะ ซึ่งมีโอกาสปนเปื้อนในสิ่งแวดล้อมนั้น จึงเป็นจุดเริ่มต้น ที่ก่อให้เกิดคำถามหลายประการในทางระบาดวิทยาและพยาธิกำเนิดของโรค ที่ต้องการการศึกษาวิจัยต่อไป
dc.description.abstractalternative	Dengue fever is an infected disease, which caused by dengue virus. The transmission of this virus emenating from Aedes aegypti mosquito. For laboratory diagnosis, the genome of virus can be detected from blood specimen of septic stage. The evolutionary of dengue virus detection have been developed to be more rapid method and high sensitivity. Moreover, there are many molecular methods that have been detected dengue genome from urine of infected patient. Interestingly urine has been the alternative clinical specimen in case of patients with severe from hemorrhage, or pediatric patients. The advantage of urine specimen is easily collected from a patient. The patient will not suffer from venipuncture. For more question if dengue genome can be detected in urine, virus would be survival. Lived dengue virus may issue of environmental contamination. The objective of this study to isolation of live dengue virus from urine of acutely-patients by assess dengue genome and protein of dengue virus in mosquito tissue and cell culture by isolation method. Acutely-infected patients in Chulalongkorn hospital is a group of samples. Urine has been confirmed by RT-PCR and ELISA in positive results (confirmation of dengue infection). Mosquito inoculation by 15 urine samples. And for cell culture isolation (C6/36) were inoculated by 40 urine samples in 12 wells culture plate. Urine through by microfilter for decontamination of urine from bacteria and another microorganism. For control group we use urine (negative results confirm by nested reverse transcription polymerase chain reaction and ELISA). Another part of the experiment. The feasibility study of urine sucking by mosquitoes. The five urine samples has been confirmed by nested RT-PCR and ELISA (positive results) . In this study we found that the isolation rate of dengue genome from RT-PCR method can be detected in patients urine 100% (13/13) and in cell culture 100%(5/5) respectively. The isolation rate of dengue protein from cell culture by immunocytochemistry shows 70% (28/40). Conclusion, percent of isolation rate were measured and showed significant of isolation rate in mosquito by genome detection is better than isolation rate in cell culture by immunocytochemistry detection (P=0.007) when significant level is smaller than 0.05. And the results from urine sucking that genome detection could not be found in mosquito tissue by RT-PCR . Dengue virus can survive in urine of acutely-infected patients and can be detected by RT-PCR method. This is a starting point of study for dengue epidemiology and pathogenicity in the future.
dc.language.iso	th
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.subject.classification	Medicine
dc.title	การแยกเชื้อไวรัสไข้เลือดออกที่มีชีวิตจากปัสสาวะของผู้ป่วยระยะติดเชื้อเฉียบพลัน
dc.title.alternative	Isolation of live dengue virus from urine of acutely-infected patients
dc.type	Thesis
dc.degree.name	วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
dc.degree.level	ปริญญาโท
dc.degree.discipline	วิทยาศาสตร์การแพทย์
dc.degree.grantor	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
dc.subject.keyword	DENGUE VIRUSES
dc.subject.keyword	IMMUNOHISTOCHEMISTRY
dc.subject.keyword	VIRUS ISOLATION
dc.subject.keyword	IMMUNOCYTOCHEMISTRY