ความหลากหลายของโพรไบโอติกแบคทีเรียในทางเดินอาหารผึ้งงานและผึ้งตัวผู้ของผึ้งมิ้ม Apis florea

Abstract

โพรไบโอติกแบคทีเรีย (probiotic bacteria) จัดเป็นจุลินทรีย์ที่ไม่ก่อโรค มีบทบาทสำคัญในการส่งเสริมสุขภาพที่ดีต่อสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน ช่วยรักษาสมดุลของภูมิคุ้มกันในระบบทางเดินอาหารและลดการบุกรุกของสิ่งมีชีวิตที่ทำให้เกิดโรคในสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน จึงทำให้ปัจจุบันคนหันมาสนใจศึกษา probiotic bacteria มากขึ้น เนื่องจากพบว่ามีโรคในผึ้งซึ่งเป็นแมลงที่สำคัญต่อการผสมเกสรพืชเศรษฐกิจจำนวนมาก ผู้วิจัยจึงสนใจที่จะค้นหา probiotic bacteria ในทางเดินอาหารของผึ้ง เพื่อนำไปสู่การสร้างสุขภาวะที่ดีของผึ้งในอนาคต และเพื่อเป็นการทดแทนหรือลดการใช้ยาปฏิชีวนะในการรักษาโรคในผึ้ง เริ่มแรกสนใจศึกษา probiotic bacteria ในผึ้งมิ้ม (Apis florea) แต่พบอุปสรรคในการเพาะเลี้ยงแบคทีเรีย ผู้วิจัยจึงเลือกใช้ผึ้งหลวง (A. dorsata) แทน นำตัวอย่างผึ้งหลวงในวรรณะผึ้งงานที่เก็บมาจากจังหวัดสมุทรสงครามจำนวน 3 ตัวมาทำการกำจัดเชื้อภายนอกตัวผึ้งด้วย 10 mL 70% ethanol เป็นเวลา 1 นาที, ตามด้วย 10 mL 6% (w/v) sodium hypochlorite เป็นเวลา 1 นาที, แล้วล้างด้วย 10 mL sterile d-H₂O เป็นเวลา 1 นาที, ตามลำดับ ตัดเอาเฉพาะส่วนท้อง (abdomen) ของผึ้งไปทำการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียเฉพาะในภาวะที่มีออกซิเจน นำส่วนท้องของผึ้งไปบดใน phosphate buffer saline ปริมาตร 700 μL ด้วย pestle พลาสติก ทำการปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 6,000 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 1 นาที, แล้วจึงดูดส่วนใส (supernatant) ปริมาตร 200 μL ลงไปเกลี่ยบนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็ง Brain heart infusion, นำไปบ่มที่อุณหภูมิ 37 °C, ข้ามคืน ทำการนับจำนวนโคโลนีเดี่ยวที่พบ สังเกตลักษณะ และทำ colony PCR เพื่อ identify ชนิดของแบคทีเรีย เลือกโคโลนี 4 โคโลนี สกัด DNA โดยใช้ปลาย pipette tip สัมผัสโคโลนีเล็กน้อย แล้วย้ายไปสู่ 10 mM TE buffer (pH 7.5) ปริมาตร 20 μL, ทำให้เซลล์แตกโดยเก็บไว้ที่ -20 °C เป็นเวลา 30 นาที, แล้วบ่มที่ 96 °C เป็นเวลา 5 นาที, แล้ว vortex, ทำซ้ำ 3 ครั้ง แล้วจึงทำการเพิ่มชิ้นส่วนของยีน 16S rRNA ด้วยวิธี Polymerase chain reaction (PCR) เตรียมปฎิกิริยา PCR ในปริมาตรสุดท้าย 25 μL ที่ประกอบด้วย 12.5 μL Emerald Amp GT PCR master mix (cat. # RR310Q, Takara), 2 μL DNA, 1 μL ของแต่ละ primer (10 μM) และ d-H2O, มีภาวะการทำงานที่เริ่มต้นด้วย 95 °C เป็นเวลา 1 นาที ตามด้วย 35 รอบของ 95 °C เป็นเวลา 1 นาที, 55 °C เป็นเวลา 1 นาที และ 72 °C เป็นเวลา 1 นาที, และสุดท้ายที่ 72 °C เป็นเวลา 7 นาที สังเกต PCR product ด้วย 0.8% (w/v) agarose gel electrophoresis, คาดหวัง PCR product ขนาด 1,400 bp, นำ PCR product ที่ได้มาทำให้บริสุทธิ์ด้วย QIAquick PCR purification kit (cat. # 28104, Qiagen) และส่งไปทำ DNA sequencing เพื่อจัดจำแนกชนิดของแบคทีเรียต่อไป จากการศึกษาเหล่านี้อาจทำให้ทราบชนิดของ probiotic bacteria ในทางเดินอาหารของผึ้งหลวง สามารถนำไปใช้เป็นแนวทางในการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่าง probiotic bacteria และสุขภาพของผึ้งเพื่อช่วยลดการเกิดโรคในผึ้ง จนนำไปสู่การเพิ่มผลผลิตของผลิตภัณฑ์ผึ้งได้ในอนาคต