ความหลากหลายของโพรไบโอติกแบคทีเรียในทางเดินอาหารผึ้งงานและผึ้งตัวผู้ของผึ้งมิ้ม Apis florea

อาภาศิริ นพรัตน์

dc.contributor.advisor	จันทร์เพ็ญ จันทร์เจ้า
dc.contributor.author	อาภาศิริ นพรัตน์
dc.contributor.other	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
dc.date.accessioned	2022-06-20T07:21:16Z
dc.date.available	2022-06-20T07:21:16Z
dc.date.issued	2563
dc.identifier.uri	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/78880
dc.description	โครงงานเป็นส่วนหนึ่งของการศึกษาตามหลักสูตรปริญญาวิทยาศาสตรบัณฑิต สาขาวิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย ปีการศึกษา 2563	en_US
dc.description.abstract	โพรไบโอติกแบคทีเรีย (probiotic bacteria) จัดเป็นจุลินทรีย์ที่ไม่ก่อโรค มีบทบาทสำคัญในการส่งเสริมสุขภาพที่ดีต่อสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน ช่วยรักษาสมดุลของภูมิคุ้มกันในระบบทางเดินอาหารและลดการบุกรุกของสิ่งมีชีวิตที่ทำให้เกิดโรคในสิ่งมีชีวิตเจ้าบ้าน จึงทำให้ปัจจุบันคนหันมาสนใจศึกษา probiotic bacteria มากขึ้น เนื่องจากพบว่ามีโรคในผึ้งซึ่งเป็นแมลงที่สำคัญต่อการผสมเกสรพืชเศรษฐกิจจำนวนมาก ผู้วิจัยจึงสนใจที่จะค้นหา probiotic bacteria ในทางเดินอาหารของผึ้ง เพื่อนำไปสู่การสร้างสุขภาวะที่ดีของผึ้งในอนาคต และเพื่อเป็นการทดแทนหรือลดการใช้ยาปฏิชีวนะในการรักษาโรคในผึ้ง เริ่มแรกสนใจศึกษา probiotic bacteria ในผึ้งมิ้ม (Apis florea) แต่พบอุปสรรคในการเพาะเลี้ยงแบคทีเรีย ผู้วิจัยจึงเลือกใช้ผึ้งหลวง (A. dorsata) แทน นำตัวอย่างผึ้งหลวงในวรรณะผึ้งงานที่เก็บมาจากจังหวัดสมุทรสงครามจำนวน 3 ตัวมาทำการกำจัดเชื้อภายนอกตัวผึ้งด้วย 10 mL 70% ethanol เป็นเวลา 1 นาที, ตามด้วย 10 mL 6% (w/v) sodium hypochlorite เป็นเวลา 1 นาที, แล้วล้างด้วย 10 mL sterile d-H₂O เป็นเวลา 1 นาที, ตามลำดับ ตัดเอาเฉพาะส่วนท้อง (abdomen) ของผึ้งไปทำการเพาะเลี้ยงแบคทีเรียเฉพาะในภาวะที่มีออกซิเจน นำส่วนท้องของผึ้งไปบดใน phosphate buffer saline ปริมาตร 700 μL ด้วย pestle พลาสติก ทำการปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 6,000 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 1 นาที, แล้วจึงดูดส่วนใส (supernatant) ปริมาตร 200 μL ลงไปเกลี่ยบนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็ง Brain heart infusion, นำไปบ่มที่อุณหภูมิ 37 °C, ข้ามคืน ทำการนับจำนวนโคโลนีเดี่ยวที่พบ สังเกตลักษณะ และทำ colony PCR เพื่อ identify ชนิดของแบคทีเรีย เลือกโคโลนี 4 โคโลนี สกัด DNA โดยใช้ปลาย pipette tip สัมผัสโคโลนีเล็กน้อย แล้วย้ายไปสู่ 10 mM TE buffer (pH 7.5) ปริมาตร 20 μL, ทำให้เซลล์แตกโดยเก็บไว้ที่ -20 °C เป็นเวลา 30 นาที, แล้วบ่มที่ 96 °C เป็นเวลา 5 นาที, แล้ว vortex, ทำซ้ำ 3 ครั้ง แล้วจึงทำการเพิ่มชิ้นส่วนของยีน 16S rRNA ด้วยวิธี Polymerase chain reaction (PCR) เตรียมปฎิกิริยา PCR ในปริมาตรสุดท้าย 25 μL ที่ประกอบด้วย 12.5 μL Emerald Amp GT PCR master mix (cat. # RR310Q, Takara), 2 μL DNA, 1 μL ของแต่ละ primer (10 μM) และ d-H2O, มีภาวะการทำงานที่เริ่มต้นด้วย 95 °C เป็นเวลา 1 นาที ตามด้วย 35 รอบของ 95 °C เป็นเวลา 1 นาที, 55 °C เป็นเวลา 1 นาที และ 72 °C เป็นเวลา 1 นาที, และสุดท้ายที่ 72 °C เป็นเวลา 7 นาที สังเกต PCR product ด้วย 0.8% (w/v) agarose gel electrophoresis, คาดหวัง PCR product ขนาด 1,400 bp, นำ PCR product ที่ได้มาทำให้บริสุทธิ์ด้วย QIAquick PCR purification kit (cat. # 28104, Qiagen) และส่งไปทำ DNA sequencing เพื่อจัดจำแนกชนิดของแบคทีเรียต่อไป จากการศึกษาเหล่านี้อาจทำให้ทราบชนิดของ probiotic bacteria ในทางเดินอาหารของผึ้งหลวง สามารถนำไปใช้เป็นแนวทางในการศึกษาความสัมพันธ์ระหว่าง probiotic bacteria และสุขภาพของผึ้งเพื่อช่วยลดการเกิดโรคในผึ้ง จนนำไปสู่การเพิ่มผลผลิตของผลิตภัณฑ์ผึ้งได้ในอนาคต	en_US
dc.description.abstractalternative	Probiotic bacteria are non-pathogenic microorganisms. It is important to promote good health for host, maintain immune balance in the digestive system and reduce the invasion of pathogenic microorganisms. Thus, it leads to an interest of many people nowadays. Since there are many diseases in honeybees, important insects in the pollination of many economic crops, we are interested in finding probiotic bacteria in the bees' digestive tract to contribute to the health of bees in the future and to replace or reduce the use of antibiotics to treat disease in bees. At the beginning, we were interested in probiotic bacteria in dwarf honeybee Apis florea but obstacles in bacterial culture were found. Hence, giant honeybee A. dorsata was used instead. Three workers of A. dorsata collected from Samut Songkhram province were externally sterilized by 10 ml of 70% ethanol for 1 min and 10 ml of 6% (w/v) sodium hypochlorite for 1 min. Then, they were rinsed with 10 ml of sterile d-H₂O for 1 min. After dry, only abdomen was used to cultivate bacteria under aerobic condition. Three abdomens were homogenized in 700 μL of 1x phosphate buffer saline with plastic pestle. The sample was spun at 6,000 rounds per min at room temperature for 1 min, and then 200 μL of supernatant was spread on Brain heart infusion agar. The plate was incubated at 37 °C, overnight. Next, number of single colonies was counted. Characteristics of colonies were observed. Colony PCR was next used to identify bacterial species. Four colonies were representative for DNA extraction. A sterile pipette tip was slightly touched a target colony and transferred to 20 μL of 10 mM TE buffer (pH 7.5). Cells were broken by keeping at -20 °C for 30 min, incubating at 96 °C for 5 min, then, mixed by vortex. It was repeated 3x. Next, partial sequences of 16S rRNA were amplified by polymerase chain reaction (PCR). A reaction mixture (final volume of 25 μL) contained 12.5 μL of Emerald Amp GT PCR master mix (cat. # RR310Q, Takara), 2 μL of DNA, 1 μL of each primer (10 μM) and d-H₂O. The condition of PCR was initially started with 95 °C for 1 min, followed by 35 cycles of 95 °C for 1 min, 55 °C for 1 min and 72 °C for 1 min. Then, the last final extension was at 72 °C for 7 min. PCR product was checked by 0.8% (w/v) agarose gel electrophoresis with the expected size of PCR product at 1,400 bp. After that, PCR product was purified by QIAquick PCR purification kit (cat. # 28104, Qiagen) and sent for DNA sequencing in order to identify bacteria species in the future. These studies might be used to identify the probiotic bacteria in the A. dorsata's digestive tract. It can be used as a guideline for studying the relationship between probiotic bacteria and bee’s health to reduce disease in bees and lead to increasing the yield of bee products in the future.	en_US
dc.language.iso	th	en_US
dc.publisher	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.rights	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US
dc.subject	โพรไบโอติก	en_US
dc.subject	ผึ้ง -- โรค	en_US
dc.subject	Probiotics	en_US
dc.subject	Bees -- Diseases	en_US
dc.title	ความหลากหลายของโพรไบโอติกแบคทีเรียในทางเดินอาหารผึ้งงานและผึ้งตัวผู้ของผึ้งมิ้ม Apis florea	en_US
dc.title.alternative	Diversity of probiotic bacteria in digestive tract of workers and drones of dwarf honeybee Apis florea	en_US
dc.type	Senior Project	en_US
dc.degree.grantor	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย	en_US