การตรวจหาชิ้นดีเอ็นเอที่มีความจำเพาะต่อเพศในเต่าตนุ Chelonia mydas

Abstract

เพื่อหาวิธีการตรวจเพศของลูกเต่าตนุโดยลูกเต่าที่ผ่านการตรวจสอบยังคงมีชีวิตอยู่จึงทำการทดลองเพื่อหาชิ้นดีเอ็นเอที่มีความจำเพาะต่อเพศของเต่าตนุโดยใช้เทคนิคทางพันธุวิศวกรรม 2 เทคนิค คือ RFLP (เซาท์เทิร์นบลอทไฮบริไดเซชัน) และ PCR–based DNA fingerprinting ใช้ GATA repeats จำนวน 21 เบส ซึ่งเป็นลำดับเบสที่จำลองมาจากส่วน conserved sequence ใน Bkm sequence ซึ่งเป็น sex-specific sequence ในสัตว์หลายชนิดโดยพบอยู่เป็นจำนวนมากใน W และ Y โครโมโซม เป็นดีเอ็นเอติดตามในการทำเซาท์เทิร์นบลอทไฮบริไดเซชันและเป็นดีเอ็นเอไพรเมอร์ในงาน PCR ถึงแม้ผลของเซาท์เทิร์นบลอทไฮบริไดเซชันในเต่าตนุที่ทราบเพศแล้วจะพบชิ้นดีเอ็นเอที่ให้ความแตกต่างระหว่างเพศ คือ พบชิ้นดีเอ็นเอขนาด 8.35 กิโลเบส เฉพาะดีเอ็นเอของเต่าตนุเพศผู้หลังตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ Hae III แต่วิธีนี้ไม่เหมาะสมที่จะนำไปใช้ในการวิเคราะห์ในลูกเต่าเพราะดีเอ็นเอที่สกัดจากเลือดของลูกเต่ามักแตกหักไม่เหมาะแก่การนำมาใช้ในงาน RFLP เมื่อใช้เทคนิค PCR โดยมี GATA repeats จำนวน 21 เบส เป็นดีเอ็นเอไพรเมอร์พบว่าที่อุณหภูมิ annealing 49℃ สามารถตรวจความแตกต่างระหว่างเพศได้โดยความเข้มของแถบดีเอ็นเอขนาด 2.29 กิโลเบส ในเพศผู้จางกว่าในเพศเมียอย่างชัดเจน เมื่อนำไปใช้ตรวจสอบเพสของลูกเต่าตนุ 2 กลุ่มโดยกลุ่มแรกเป็นลูกเต่าที่เสียชีวิตระหว่างการอนุบาลและนำมาจำแนกเพศโดยการศึกษาลักษณะเนื้อเยื่อของโกแนดส่วนกลุ่มที่สองเป็นลูกเต่าที่มีชีวิตซึ่งเพาะฟักโดยการควบคุมอุณหภูมิและคาดเดาเพศจากอุณหภูมิที่ใช้เพาะฟัก จากการศึกษาพบว่าผลการจำแนกเพศโดยใช้เทคนิค PCR ตรงกับผลการศึกษาลักษณะเนื้อเยื่อโกแนดร้อยละ 75 และผลการจำแนกเพศโดยใช้เทคนิค PCR ตรงกับเพศของลูกเต่าที่คาดไว้จากการกำหนดอุณหภูมิในการเพาะฟักร้อยละ 67 แสดงว่าเทคนิค PCR นี้สามารถนำมาใช้ในการตรวจเพศได้โดยมีความถูกต้องเกินร้อยละ 50