การตรวจหาแบคทีเรีย Vibrio spp. ในอาหารโดย RT-PCR และ PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

Abstract

งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินความเป็นไปได้ในการประยุกต์ใช้เทคนิค PCR-DGGE และ RT- PCR-DGGE สำหรับตรวจสอบแบคทีเรียกลุ่มวิบริโอในระบบนิเวศอาหาร โดยเริ่มจากประเมินการใช้ไพรเมอร์ GC567F และ 680R ในการเพิ่ม DNA และ cDNA ของเชื้อมาตรฐานกลุ่มวิบริโอทั้งหมด 10 สปีซีส์ด้วยวิธีพีซีอาร์ และแยกความแตกต่างของผลผลิตพีซีอาร์ด้วยเทคนิค DGGE โดยใช้โพลีอะคลิลาไมด์เจลเข้มข้น ร้อยละ 10 (w/v) ที่มีเกรเดียนต์ของสารดีเนเจอร์แรนคือยูเรียและฟอร์มาไมด์เข้มข้นร้อยละ 45-70 พบว่าเทคนิคดีจีจีอีสามารถแยกแถบ DNA และ cDNA ของเชื้อวิบริโอทั้ง 10 สปีซีส์ได้ไม่แตกต่างกัน โดยพบ DNA และ cDNA ที่ไม่สามารถแยกออกจากกันได้จำนวน 2 คู่ คือ Vibrio fluvialis กับ Vibrio furnissii และ vibrio parahaemolyticus กับ vibrio harveyi เมื่อประเมินค่าต่ำสุดที่วิเคราะห์ได้ (detection limit) ของวิธีในการตรวจสอบชุมชนของเชื้อวิบริโอทั้ง 10 สปีซีส์ที่มีความเข้มข้นเซลล์เท่ากัน พบว่าเทคนิค PCR-DGGE ตรวจพบเชื้อวิบริโอได้เพียง 3 สปีซีส์คือ Vibrio cholerae, Vibrio mimicus และ Vibrio alginolyticus ในขณะที่เทคนิค RT-PCR-DGGE ตรวจพบเชื้อวิบริโอได้ถึง 5 สปีซีส์ คือ vibrio choleroe, vibrio mimicus, vibrio alginolyticus, vibrio parahaemolyticus และ vibrio fluvialis และเมื่อตรวจสอบชุมชนของเชื้อวิบริโอที่มีชนิดและความเข้มข้นองเซลล์แตกต่างกัน (แปรค่าตั้งแต่ 10²-10⁵ CFU/ml) PCR-DGGE ตรวจ พบแถบ DNA ของวิบริโอสปีซีส์ที่มีความเข้มข้นเซลล์สูงสุดลองลำดับแรกในกลุ่ม ในขณะที่ RT-PCR-DGGE แถบ cDNA ของวิบริโอสปีซีส์ที่มีความเข้มข้นเซลล์แตกต่างกันได้ถึงห้าลำดับแรกในกลุ่ม ดังนั้นจึง เลือกเทคนิค RT-PCR-DGGE สำหรับประเมินการใช้งานต่อไป เมื่อประเมินผลของสภาวะเซลล์ต่อการตรวจ พบวิบริโอด้วยเทคนิคดังกล่าว ได้แก่ สภาวะเซลล์สมบูรณ์ (VC) เซลล์บาดเจ็บจากการแซ่เยือกแข็ง (IVC) และเซลล์บาดเจ็บจากการแช่เยือกแข็งที่ผ่านการ pre-enrichment (PIVC) พบว่าตรวจพบแถบ cDNA ของ เซลล์จากทุกสภาวะได้ไม่แตกต่างกัน ยกเว้นเซลล์ของ plesiomonas shigelloides ภายใต้ สภาวะ IVC และ PIVC ปรากฏแถบ cDNA มากกว่า 1 แถบ เมื่อประเมินการใช้เทคนิค RT-PCR-DGGE สำหรับการตรวจ สอบ วิบริโอในตัวอย่างอาหารโดยเติมเซลล์ vibrio parahaemolyticus ลงในตัวอย่างอาหารที่ปราศจากเชื้อ พบว่าวิธีดังกล่าวสามารถตรวจพบ vibrio parahaemolyticus ในอาหารได้ตั้งแต่ 10² CFU/g และให้ผลที่ เป็นไปในแนวทางเดียวกับวิธีมาตรฐาน (FDA-BAM, 2004) และเมื่อประยุกต์ใช้เทคนิค RT-PCR-DGGE ใน การตรวจสอบเชื้อ วิบริโอในอาหาร จำนวน 14 ตัวอย่าง พบว่ารูปแบบของวิบริโอที่ตรวจพบด้วยเทคนิค RT-PCR-DGGE ให้ผลที่สอดคล้องกับวิธีมาตรฐานร้อยละ 100 จำนวน 3 ตัวอย่าง 75 จำนวน 1 ตัวอย่าง ร้อยละ 50 จำนวน 6 ตัวอย่าง และให้ผลไม่สอดคล้องกับวิธีมาตรฐาน จำนวน 4 ตัวอย่าง