การพัฒนาวิธีการตรวจสอบรีคอมบิแนนต์ดีเอ็นเอในมะละกอและผลิตภัณฑ์มะละกอ

Abstract

พัฒนาวิธีการตรวจสอบรีคอมบิแนนต์ดีเอ็นเอในมะละกอและผลิตภัณฑ์ด้วยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสเริ่มจากทดสอบหาวิธีสกัดดีเอ็นเอที่เหมาะสม สำรวจชุดยีนที่เกี่ยวข้อง ออกแบบไพรเมอร์และปรับภาวะของปฏิกิริยา นอกจากนี้ยังได้พัฒนาดีเอ็นเอเพื่อใช้อ้างอิงจนสามารถประกอบเป็นวิธีที่ใช้ตรวจสอบอาหารในท้องตลาด ในเบื้องต้นพบว่าสำหรับเนื้ออาหารที่เป็นมะละกอสดและทุกเนื้ออาหารที่เป็นมะละกอแปรรูปที่พบในประเทศ วิธีสกัดดีเอ็นเอด้วยเรซินสังเคราะห์มีความเหมาะสมมากกว่าวิธีที่ใช้ cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) การศึกษาโครงสร้างของยีนที่เกี่ยวข้องในรีคอมบิแนนต์ดีเอ็นเอพบยีนพาเพนมีความเหมาะสมในการออกแบบสร้างไพรเมอร์เพื่อเพิ่มปริมาณส่วนของยีนพาเพนในธรรมชาติขนาด 280 นิวคลีโอไทด์ และพบยีนโปรตีนเปลือกหุ้มขนาด 800 นิวคลีโอไทด์ ที่พบทั้งในมะละกอดัดแปรพันธุกรรมที่วางจำหน่ายเป็นการค้า และมะละกอที่กำลังอยู่ในระหว่างการวิจัยเป็นแม่แบบในการสร้างไพรเมอร์เป้าหมายในการตรวจโดยพบว่าภาวะเหมาะสมโดยเฉพาะอุณหภูมิ annealing ของปฏิกิริยาเป็น 52°C 2 นาที และความเข้มข้นของเกลือแมกเนเซียมที่เหมาะสมเป็น 1.5 µmole ความไวของปฏิกิริยาในการตรวจดีเอ็นเอ (senstivity) ของยีนพาเพนและยีนโปรตีนเปลือกหุ้มต่ำสุดอยู่ที่ 1.9635 pg/µl และ 1.7538 pg/µl ความน่าเชื่อถือในรูปการทำซ้ำ (reproducibility) และความจำเพาะ (specificity) อยู่ที่ 99% และ 100% ตามลำดับ สำหรับดีเอ็นเออ้างอิงสังเคราะห์สร้างจากการรวมชิ้นส่วนของยีนพาเพน 35S โปรโมเตอร์ ยีนโปรตีนเปลือกหุ้มและเทอร์มิเนเตอร์ด้วยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสร่วมกับการเชื่อมต่อด้วยไลเกส และโคลนเข้าสู่พลาสมิด pCRLL ด้วยหลักการ TA cloning ดีเอ็นเออ้างอิงในรูปพลาสมิดที่ได้มีความไวต่อการตรวจแม้ในระดับความเข้มข้นที่ต่ำเพียง 2.9634 pg/µl และเมื่อนำวิธีที่ได้ไปตรวจสอบอาหารในท้องตลาดจำนวน 3024 ตัวอย่างสามารถทดสอบยีนพาเพนได้ทั้งหมดและตรวจพบมะละกอดัดแปรพันธุกรรมจากตัวอย่างผลิตภัณฑ์นำเข้า 1 ตัวอย่าง วิธีที่ได้สามารถนำไปเชื่อมโยงเพื่อตรวจรับรองภาวะปลอดจากการดัดแปรพันธุกรรม (GMOs Free) กับมะละกอเพื่อการส่งออกได้