การผลิตกรด 6-อะมิโนเพนนิซิลานิกโดยใช้เซล Escherichia coli ที่ถูกตรึง

Abstract

ได้ทำการคัดเลือกพันธุ์แบคทีเรียที่ผลิตเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลสสูง จากแบคทีเรีย 3 สายพันธุ์ คือ E.coli ATCC 9637, ATCC 11105 และ S.rubidaea ATCC 181 โดยอาศัยคุณสมบัติการต้านยาเพนนิซิลิน จี และรูปแบบการเจริญและการผลิตเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส เป็นดัชนี พบว่า E.coli ATCC 9637 จะให้แอคติวิตีของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลสสูงสุด เมื่อเจริญในอาหารสูตรต่ำที่ 30 องศาเซลเซียส เมื่อมี 0.2 เปอร์เซ็นต์ กรดฟีนิลอะซีติกเป็นตัวชักนำ สภาวะเหมาะสมในการเจริญและการผลิตเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส E.coli ATCC 9637 คือ อาหารสูตรปรับต่ำที่เสริมด้วย 0.2 เปอร์เซ็นต์ กรดฟีนิลอะซีติก และ 0.5 เปอร์เซ็นต์โซเดียมกลูตาเมตเป็นตัวชักและสารต้นตอ ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 28-30 ชั่วโมง แอคติวิตีของเอนไซม์ที่ได้ในสภาวะนี้มีค่าประมาณ 40 หน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีนสุทธิของเซล ที่ค่าการเจริญ 440 หน่วยเคลต ถ้าอุณหภูมิในการเลี้ยงเชื้อเพิ่มสูงกว่า 30 องศาเซลเซียสหรือใช้กลูโคสเป็นสารต้นตอคาร์บอนในอาหารเลี้ยงเชื้อจะเป็นผลให้แอคติวิตีของเอนไซม์ต่ำลง นอกจากนี้ถ้าเสริมกรดฟีนิลอะซีติกสูงกว่า 0.2 เปอร์เซ็นต์ ก็จะมีผลลดแอคติวิตีของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลสด้วย ในการตรึงเซล E.coli ATCC 9637 ด้วยแคปปา-คาร์ราจีแนนและวุ้น พบว่าสภาวะที่เหมาะสมคือ ปริมาณความเข้มข้นของเซล 10-15 เปอร์เซนต์ (น้ำหนัก่อน้ำหนัก) ตรึงด้วยแคปปา-คาร์ราจีแนน 2.5 เปอร์เซนต์ (น้ำหนักต่อต่ปริมาตร) ขนาดรูปร่างลักษณะตลอดจน strength ของม็ดเจลตรึงแปรตามปัจจัยดังต่อไปนี้ คือ ความเร็วในการกวนสารละลาย, ชนิดของวัสดุตรึง, ความเข้มข้นของวัสดุตรึง และความเข้มข้นของเซลที่ใช้ รวมทั้งขนาดของเม็ดเจลเซลตรึงจะมีผลกระทบต่อแอคติวิตีของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลสในเซลตรึงแคปปา-คาร์ราจีแนน ค่า % activity recovery ในเซลตรึงคาร์ราจีแนน (85-90 เปอร์เซนต์) จะสูงกว่าค่าที่วัดได้ในเซลตรึงวุ้น (75-80 เปอร์เซนต์) การเสริมด้วยกลูตารัลดีไฮด์ 0.1 โมลาร์ ไม่มีผลเพิ่ม strength ของเจลตรึงทั้งสองชนิด แต่ลจะลด % activity recovery ของเซลตรึงทั้ง 2 ชนิดลงบ้าง และมีผลเพิ่มความเสถียรของเอนไซม์ในเซลตรึงเจลได้บ้างเล็กน้อย การเสริมด้วยกลูตารัลดีไฮด์ 0.1 โมลาร์และเฮกซาเมทธิลลีนไดอามีน 0.1 โมลาร์หลังตรึงเวลจะมีผลในการเพิ่ม strength ของเม็ดเจลเซลตรึงแคปปา-คาร์ราจีแนน มากกว่า 2 เท่าตัว ในขณะที่ strength ของม็ดเจลเซลตรึงวุ้นเพิ่มขึ้นบ้างเล็กน้อย ผลการเปรียบเทียบสมบัติของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส ในเซล E.coli ATCC 9637 อิสระ; เซล E.coli ATCC 9637 ตรึงวุ้นและแคปปา-คาร์ราจีแนนเสริมกลูตารัลดีไฮด์และเฮกซาเมทธิลลีนไดอามีน ให้ผลดังนี้ pH เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยาการไฮโดรไลซ์เพนนิซิลินจี มีค่า 7.5-8.5, 6.5 และ 7.0-7.5 อุณหภูมิเหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยาคือ 50, 55 และ 50-55 องศาเซลเซียส ตามลำดับ พบว่าเอนไซม์ในเซลตรึงจะมีความสามารถในการทนทานต่อสภาวะที่เป็นกรด มากกว่าในเซล E.coli อิสระ เอนไซม์ในเซลตรึงและเซลอิสระสามารถเก็บไว้ที่ 37 องศาเซลเซียส นาน 5 ชั่วโมง โดยไม่สูญเสียแอคติวิตีเลย สำหรับค่าคงที่ทางจลน์ศาสตร์ของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลสในเซล E.coli ATCC 9637 อิสระ, เซล E.coli ATCC 9637 ตรึงวุ้นและตรึงแคปปา-คาร์ราจีแนนเสริมกลูตารัลดีไฮด์และเฮกซาเมทธิลลีนไดอามีน มีค่าดังนี้ Ki ของเพนนิซิลิน จี ; 6.7, 5.5 และ 3.1 มิลลิโมลาร์ Vmax ; 16.7, 6.7 กรดฟีนิลอะซีติก 5.3 หน่วยต่อกรัมเซลอิสระ ตามลำดับ Ki ของกรดฟีนิลอะซีติก ; 4.0, 8.0 และ 7.0 มิลลิโมลาร์ และ Ki ของกรด 6-อะมิโนเพนนิซิลานิก ; 12.3, 20.3 และ 35.3 มิลลิโมลาร์ ตามลำดับ เมื่อเก็บรักษาเซล E.coli ATCC 9637 ในนอร์มอลซาลีนที่ 4 องศาเซลเซียส นาน 80 วันจะมี แอคติวิตีของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลสเหลืออยู่ 80 เปอร์เซนต์ และเก็บเซล E.coli ATCC 9637 ตรึงวุ้นและตรึงแคปปา-คาร์ราจีแนนเสริมกลูตารัลดีไฮด์และเฮกซาเมทธิลลีนไดอามีน ไว้ในนอร์มอลซาลีน และ 0.3 โมลาร์โพแตสเซียมคลอไรด์ที่ 4 องศาเซลเซียสจะเก็บได้นาน 30 วัน โดยไม่มีการสูญเสียแอคติวิตีของเอนไซม์ นอกจากนี้พบว่า E.coli ATCC 9637 ตรึงวุ้น และตรึงแคปปา-คาร์ราจีแนนเสรัมกลูตารัลดีไฮด์ และเฮกวาเมทธิลลีนไดอามีน จะยังคงแอคติวิตีของเพนนิซิลิน เอซิเลสอย่างสมบูรณ์ เมื่อทำการวัดทุกๆ 5 วันเป็นเวลาอย่างน้อย 30 วัน โดยไม่มีการสูญเสียแอคติวิตีของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส